肖 嫻,康文藝

(1.河南大學淮河醫(yī)院外科,河南 開封 475001;2.河南大學藥學院,河南 開封 475004)

兒茶素抗氧化微量法探討

肖 嫻1,康文藝2＊

(1.河南大學淮河醫(yī)院外科,河南 開封 475001;2.河南大學藥學院,河南 開封 475004)

目的:利用具有清除DPPH自由基活性的化合物兒茶素建立一種體外微孔板抗氧化模型。方法:通過單因素考察,建立L9(34)正交試驗,對結(jié)果進行直觀分析和方差分析,確定最適實驗條件。驗證實驗證明該方法的穩(wěn)定性;標準品對照實驗,表明該模型的準確性。結(jié)果:最適實驗條件是A3B1D2,即DPPH的最佳濃度為250μmol/L,加入量為125μL,反應20min;驗證實驗 RSD為1.06%。結(jié)論:DPPH抗氧化微量篩選模型快速,準確,用樣量小,且穩(wěn)定可靠,適合天然產(chǎn)物抗氧化活性篩選使用。

兒茶素;微孔板;DPPH;抗氧化模型

兒茶素(Catechin)是綠茶多酚的主要有效成分,存在于茶樹(Camel Iiasinenis o.Ktze.)等多種天然藥用植物中[1],其藥理作用廣泛,有人總結(jié)為“三抗”、“三降”和“三消”[2]。因其電子傳遞機理[3]而具有很強的抗氧化活性[4]。我們以兒茶素為研究對象,通過微孔板法試驗,建立一種微量法篩選模型,可用于天然產(chǎn)物的批量快速篩選。

1 實驗材料

1.1 試劑

DPPH(日本東京化成工業(yè)株式會社)、PG(pro pyl gallate,沒食子酸丙酯,Sigma批號:A019043001)、BHA(Butylated hydroxyanisole,丁基羥基茴香醚,Sigma 批號:A019438801)、BHT(Butylated hydroxy toluene,二丁基羥基甲苯,Sigma批號:A020158601)、Trolox(Aldrich)、兒茶素(本研究所提供,純度98%)。

1.2 儀器

Multiskan M K3酶標儀(美國 thermo Electron公司);UV-2000型紫外-可見分光光度計(尤尼可上海儀器有限公司);電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);CS-H1型混合器(北京博勵陽科技公司);96微孔板;各種移液器及槍頭等。

2 方法和結(jié)果

2.1 單因素考察

2.1.1 DPPH濃度的考察 選擇DPPH(甲醇溶液)濃度為 300、250、200、150、100 和 50μmol/L。0.5mg/mL的兒茶素(甲醇溶液),對半稀釋6個濃度。分別把不同濃度的兒茶素溶液10μl加入到96微孔板中,加入150μL DPPH溶液,反應20min后,在492nm處測定OD值(n=6);用SPSS13.0軟件處理實驗數(shù)據(jù),得到兒茶素清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度即 IC50值,并進行單因素方差分析(表1和圖1)。

表1 DPPH濃度的影響(,n=6)

表1 DPPH濃度的影響(,n=6)

圖1 DPPH濃度的影響

由圖1可知,IC50隨著DPPH濃度增加,呈現(xiàn)一定線性的增加,且在200μmol/L時增加最慢,查閱相關(guān)中外文獻發(fā)現(xiàn),在DPPH微量法的不同篩選體系中,DPPH濃度范圍在50～300μmol/L[5-10],故選取200μmol/L。

2.1.2 DPPH加入量的考察 選擇DPPH(甲醇溶液)加入量為 250、225、200、175、150、125 和 100μL,DPPH濃度取200μmol/L,其他操作同2.1.1(n=6);(圖2)。

圖2 DPPH加入量的影響

由圖2可以看出,隨DPPH加入量的增加,兒茶素由過量至完全與DPPH自由基作用,然后達到DPPH過量,而導致在100～250μL之間時,IC50呈波狀上升趨勢,在DPPH加入量為150μL時,兒茶素與DPPH作用最充分。

2.1.3 反應時間的考察 根據(jù)查閱DPPH微量法的相關(guān)文獻,選擇反應的時間為 60、50、40、30、20、10、0min,DPPH加入量為 150μL,其他操作同2.1.2(n=6);(見圖 3)。

圖3 反應時間的影響

隨時間兒茶素與DPPH的作用充分,IC50值也相應的不斷減小,前10min減小最快,10～20min次之,之后幾乎沒變化,20min時反應已基本充分。

2.2 正交實驗

選擇DPPH濃度、DPPH加入量和反應時間為主要因素,進行正交設(shè)計(表2),按L9(34)正交表試驗(n=3),(表3和表4)。

表2 因素水平表

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由表3的 R值可知,各因素影響順序是A>D>B。說明DPPH濃度是重要影響因素,反應時間和DPPH加入量次之。由表4可知,因素A有顯著性影響,最佳水平為A3;因素B沒有顯著性影響,為了節(jié)省樣品,取B1;因素D也沒有顯著性影響,結(jié)合實驗操作所需的時間,取單因素考察的最佳水平D2。故最佳實驗條件為:A3B1D2,即DPPH的濃度為250 μmol/L,加入量為 125μL,反應 20min。

表4 方差分析表

2.3 驗證實驗

按最佳實驗條件進行驗證試驗(n=3),RSD為1.06%,結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.4 標準品對照比較

采用Trolox作參比,PG,BHA和BHT作陽性對照。分別用微量法和分光光度法[11]對 Trolox,PG,BHA,BHT和兒茶素進行抗氧化活性測定,結(jié)果微量法得到的 IC50值約是分光光度法的3倍,但用 Trolox當量(單位是μmol/g,表示每摩爾樣品清除DPPH自由基的能力相當于參比物 Trolox的微摩爾數(shù))表示,因體系引起的差異;且2種方法測得的活性順序一致,即 PG>兒茶素>BHA>Trolox>BHT。證明微量法在評價待測物的抗氧化活性時,和分光光度法一樣準確。

3 討論

我們參閱國外有關(guān)文獻,通過單因素試驗,建立L9(34)正交試驗,對結(jié)果進行直觀分析和方差分析,確定適宜的條件為A3B1D2,即DPPH的濃度為250 μmol/L,加入量為125μL,反應 20min。驗證實驗RSD為1.06%,表明該模型穩(wěn)定可靠,有良好的精密度和重現(xiàn)性。用 Trolox作參比,PG、BHA和BHT作陽性對照,與分光光度法相比較,2種方法所得Trolox當量高度相關(guān)(r=1),表明因體系引起的誤差已經(jīng)消除,微量法可以準確衡量樣品清楚DPPH自由基的能力。另外,微量法可檢測到濃度在1.1～38μg/mL之間的樣品,靈敏度有所提高。

我們首次把正交試驗引入到DPPH抗氧化模型的建立中,并且分別對DPPH微量法的穩(wěn)定性、準確性和可行性進行了系統(tǒng)的考察和分析,為DPPH微量法的應用和發(fā)展提供了科學依據(jù)。

綜上所述,用兒茶素所建立的抗氧化微量模型與分光光度法相比,快速、準確、用樣量小,且穩(wěn)定可靠,適合天然產(chǎn)物單體抗氧化活性的快速篩選。

[1]彭長連,陳少薇,林植芳,等.用清除有機自由基DPPH法評價植物抗氧化能力[J].生物化學與生物物理進展,2000,27(6):658-662.

[2]范娟,許士凱.茶多酚藥理作用的研究進展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2002,11(22):2301-2302.

[3]毛清黎,施兆鵬,李玲,等.茶葉兒茶素保健及藥理功能研究進展[J].食品科學,2007,28(8):584-589.

[4]Wang L F,Zhang H Y.A theoretical study of the different radical-scavenging activities of catechin,quercetin,and rationally designed planar catechin[J].Bioorganic Chem,2005(33):108-115.

[5]Sang S M,Cheng X F,Stark R E,et al.Chemical studies on antioxidant mechanism of tea catechins:analysis of radical reaction products of catechin and epicatechin with 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl[J].Bioorganic &Med Chem,2002(10):2233-2237.

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[10]Chen F A,Wu A B,Shieh P,et al.Evaluation of the antioxidant activity of Ruellia tuberosa[J].Food Chem,2006(94):14-18.

[11]Badami S,Rai S R,Suresh B.Antioxidant activity of Aporosa lindleyana root[J].J Ethnopharmaco,2005(101):180-184.

[責任編輯 李武營]

Antioxidant assay for catechin with microplate based screening method

XIAO Xian,KANG Wen-yi(Huaihe Hospital of Henan University,Kaif eng,Henan475001,China;Pharmacelltical College of Henan University,Kaif eng,Henan475004,China)

Objective:To establish an antioxidant model of microplate assay in vitro by catechin which is a compound with the activities to eliminate DPPH free radical.Methods:L9(34)orthogonal experiment was established by the single factor exploration.The result was conducted the direct-viewing analysis and variance analysis to determine the optimum experiment conditions.The evaluation experiment showed that the method was stable and the control experiment of standard further certified the precision of the model.Results:The optimum condition was A3B1D2,that was,the concentration of DPPH was 250μmol·L-1,the addition volume of DPPH was 125μL and kept 20min at room temperature.RSD of the evaluation test was 1.06%.Conclusion:The microplate assay is rapid,accurate,stable and reliable for the screening antioxidant activity of traditional Chinese medicine with little sample,and it fits for the screening antioxidant activities of natural materials.

Catechin;Microplate;DPPH free radical;Antioxidant model

Q946.81

A

1672-7606(2010)04-0270-03

2010-10-08

肖嫻(1980),女,河南 開封 人,護師,從事臨床護理工作。

＊通訊作者:康文藝(1971-),男,黑龍江尚志市人,醫(yī)學博士后,副教授,從事天然藥物活性成分研究工作。