胡 燁,李 影,錢愛(ài)東

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130118)

由于基因組學(xué)研究的發(fā)展,近年對(duì)基因的研究已由靜態(tài)的結(jié)構(gòu)研究轉(zhuǎn)向動(dòng)態(tài)的基因表達(dá)和功能研究,以基因組功能研究為主要目標(biāo)的后基因組時(shí)代即將來(lái)臨,基因功能信息的獲取將成為后基因組研究的重點(diǎn)。而差異基因和基因差異表達(dá)的研究是獲取基因功能信息的重要方法,目前篩選并克隆差異基因也已成為當(dāng)前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。然而,值得注意的是此方面的研究目前大都局限于真核生物領(lǐng)域,而在原核生物差異基因篩選方面的研究頗少。

目前研究基因差異表達(dá)的技術(shù)大都是以m RNA為材料進(jìn)行的,而原核生物由于其mRNA缺少po ly(A),因此要獲得其足夠的m RNA是非常困難的[1-2]。雖然目前已有一些富集原核生物m RNA的試劑盒,但由于RNA本身特點(diǎn)所致其富集m RNA的效率不是很高[3-5]。因此,許多差異表達(dá)分析技術(shù)無(wú)法應(yīng)用于原核生物差異基因的篩選。然而對(duì)于原核生物差異基因的研究,尤其是一些致病菌的研究同樣是十分有意義的。本文就幾種可應(yīng)用于原核生物的基因差異表達(dá)分析技術(shù)做簡(jiǎn)要介紹。

1 代表性差異分析法

代表性差異分析法(representational difference analysis,RDA)基本原理是將差減雜交與PCR結(jié)合,根據(jù)以雙鏈DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增,而以單鏈DNA為模板則呈線性擴(kuò)增的原理,首先提取處理組和對(duì)照組的總RNA或mRNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用識(shí)別4個(gè)堿基的內(nèi)切酶充分消化,然后進(jìn)行PCR,使兩組cDNA片段得以富集,接著連續(xù)進(jìn)行3次差減雜交,去除共有基因,最后利用PCR技術(shù)富集試驗(yàn)組中特異表達(dá)基因的cDNA片段[6]。

與其他方法相比,cDNA-RDA具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):①cDNA-RDA技術(shù)富集差異表達(dá)基因的效率比其他方法高,可以篩選出低拷貝的差異基因。這是因?yàn)樵摷夹g(shù)通過(guò)酶切,簡(jiǎn)化了基因組DNA的復(fù)雜性而大大提高了消減雜交的消減富集;另外通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行了高效的動(dòng)力學(xué)富集[7];②cDNARDA與mRNA-DD相比,它通過(guò)PCR擴(kuò)增及消減雜交,抑制了群體間共有基因片段擴(kuò)增,使差異表達(dá)基因呈指數(shù)擴(kuò)增,增加了群體間差異基因(陽(yáng)性基因)的靈敏度,大大地減少了假陽(yáng)性的出現(xiàn)率。③cDNA-RDA使用較長(zhǎng)的引物(24mer),避免了在mRNA-DD技術(shù)中使用短的隨機(jī)引物引起的錯(cuò)誤匹配,且其得到的擴(kuò)增子基本上可以代表整個(gè)cDNA信息[8];④cDNA-RDA技術(shù)除可以發(fā)現(xiàn)Driver和Tester間存在的基因表達(dá)差異外,還可進(jìn)行組間“雙向”差減,并可進(jìn)行直接克隆和測(cè)序;如果降低Driver和Tester的比例,可用于篩查相對(duì)差異;⑤在試驗(yàn)過(guò)程中可及時(shí)對(duì)差減雜交的效果進(jìn)行檢測(cè),避免人力、物力不必要的浪費(fèi)。而且對(duì)試驗(yàn)儀器要求較簡(jiǎn)單,一般的實(shí)驗(yàn)室都可以展開此方面試驗(yàn)。

當(dāng)然,cDNA-RDA技術(shù)也存在著一些不足。如試驗(yàn)步驟比較復(fù)雜,對(duì)試驗(yàn)樣品要求較高,限制性內(nèi)切酶可能造成的cDNA兩端的信息丟失等。但因其顯著的優(yōu)點(diǎn)cDNA-RDA方法目前已被廣泛的應(yīng)用于基因差異表達(dá)研究,尤其是現(xiàn)在研究較少的原核生物的差異基因篩選。與真核生物相比,原核生物的m RNA非常的不穩(wěn)定,一般情況下在37℃其mRNA半衰期只有1.5min～2.5 min;而且由于其mRNA缺少poly(A),無(wú)法使用Oligo(dT)進(jìn)行常規(guī)的m RNA純化[9]。因此,目前在原核生物差異基因表達(dá)方面的研究,大都是以總RNA為試驗(yàn)材料代替m RNA來(lái)進(jìn)行研究,Bow ler L D等[10]發(fā)展了cDNA-RDA方法,并成功的將其應(yīng)用于腦肺炎雙球菌的差異基因篩選。以編碼與鐵元素調(diào)節(jié)相關(guān)的乳鐵蛋白受體基因缺失N.meningitidis(CE1402)和其同系菌株N.meningitides(M 986)為對(duì)象,分別將其置于鐵元素充分以及鐵元素缺乏的環(huán)境中培養(yǎng)。最終成功的得到5個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,其中包括去鐵元素調(diào)控相關(guān)的基因片段lbpA和frpC。

2 抑制消減雜交法

抑制消減雜交法(suppression subtractive hybridization,SSH)是以抑制PCR為基礎(chǔ)的cDNA差減雜交技術(shù)。通過(guò)抑制PCR完成檢測(cè)子和驅(qū)動(dòng)子單鏈cDNA豐度的均等化;通過(guò)差減雜交去除檢測(cè)子和驅(qū)動(dòng)子之間的共同序列,使檢測(cè)子和驅(qū)動(dòng)子之間的不同序列得到擴(kuò)增,從而富集差異表達(dá)基因。整個(gè)過(guò)程既利用了差減富集又利用了抑制PCR技術(shù)的高效動(dòng)力學(xué)富集,因此SSH顯著增加了獲得低豐度表達(dá)差異的cDNA的概率,簡(jiǎn)化了差減文庫(kù)的分析。

SSH是目前為止較為簡(jiǎn)單有效的尋找差異基因的方法,其主要優(yōu)點(diǎn)如下[11]:①靈敏度高。一般說(shuō)來(lái),經(jīng)過(guò)SSH,稀有豐度cDNA能富集1 000倍～5 000倍,這種富集作用使得低至每細(xì)胞一個(gè)拷貝的分子也有可能被檢出;②提高了基因克隆的效率,由于使用4堿基內(nèi)切酶使得基因(組)的復(fù)雜程度降低,大大提高了信息量,在一次SSH試驗(yàn)中可同時(shí)分離出上百個(gè)差別表達(dá)的基因;③假陽(yáng)性率低;④操作簡(jiǎn)單,速度快,效率高。一次SSH可以同時(shí)分離到幾十甚至幾百個(gè)差異表達(dá)的基因[12];⑤PCR產(chǎn)物既可用作探針作文庫(kù)篩選,也可直接進(jìn)行克隆,構(gòu)建差減文庫(kù)。

但是,SSH也有缺點(diǎn),如其對(duì)于材料的要求較多。該技術(shù)需要幾微克的m RNA,若mRNA量不足,很可能檢測(cè)不到低豐度差異表達(dá)基因的cDNA。這一點(diǎn)使SSH技術(shù)在原核生物的研究領(lǐng)域應(yīng)用受限。對(duì)于原核生物差異基因的研究,多是對(duì)于其基因組的比較差異研究,然后再間接研究差異表達(dá)的基因[13]。有人采用SSH對(duì)BCG及其相關(guān)結(jié)核分支桿菌進(jìn)行了基因組差異性研究。發(fā)現(xiàn)BCG較產(chǎn)毒株缺失了3個(gè)獨(dú)立基因區(qū),并將其命名為RD1、RD2和RD[14]。利用SSH對(duì)水、陸兩棲動(dòng)物和人致病菌水生氣單胞菌產(chǎn)毒株P(guān)PD134/91及非產(chǎn)毒株P(guān)PD 35/85進(jìn)行了基因差異顯示研究。共獲得69個(gè)PPD 134/91株特異片段,其中23個(gè)片段所編碼的16個(gè)ORF與其他細(xì)菌已知蛋白具有高度同源性,而剩余的46個(gè)片段所編碼的ORF被認(rèn)為是該菌所特有的蛋白質(zhì)[15]。

用可以降解甲苯的惡臭假單胞菌建立了一個(gè)應(yīng)用于原核生物的模式系統(tǒng)[16]。發(fā)現(xiàn)超過(guò)90%的克隆序列都含有編碼于甲苯相關(guān)酶類的基因片段,并對(duì)其中來(lái)自于3個(gè)主要操縱子的20個(gè)顯著的甲苯相關(guān)基因進(jìn)行了測(cè)序。該方法可以作為針對(duì)原核生物的差異基因鑒定的針對(duì)性研究方法,稱該方法為應(yīng)用于原核生物的SSH PCR cDNA消減方法[17]。

3 互補(bǔ)脫氧核酸擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)

互補(bǔ)脫氧核酸擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(DNA amplified fragment length polymorphism,cDNAAFLP)技術(shù)結(jié)合了RT-PCR和AFLP技術(shù),其基本原理是以純化的m RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用識(shí)別序列分別為6 bp和4 bp的兩種限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA,酶切片段與人工接頭連接后,利用與接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示[18]。

cDNA-AFLP的主要優(yōu)點(diǎn)有:①轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物高度表達(dá)時(shí),擴(kuò)增條帶的強(qiáng)度能夠準(zhǔn)確反映基因間表達(dá)量的差別。②“假陽(yáng)性”低。在RNA指紋圖譜分析等技術(shù)中,如何證實(shí)被分離的電泳條帶和證實(shí)最初擴(kuò)增反應(yīng)體系中被標(biāo)記和識(shí)別的條帶是個(gè)難點(diǎn)[19]。而cDNA-AFLP技術(shù),只需要增加選擇性堿基長(zhǎng)度即可排除PCR中非目標(biāo)電泳條帶的擴(kuò)增。③重復(fù)性高。cDNA-AFLP技術(shù)在cDNA酶切片段兩端加上了接頭片段,增強(qiáng)了引物結(jié)合的特異性,其重復(fù)率可達(dá)95%以上[20]。

cDNA-AFLP方法大都應(yīng)用于高等生物體或是植物的基因表達(dá)特性的研究,而從未在原核生物差異基因表達(dá)方面應(yīng)用。近幾年來(lái)逐漸有報(bào)道應(yīng)用該方法研究原核生物的差異基因表達(dá)[21]。用該方法研究胡蘿卜軟腐歐文菌的兩個(gè)亞種Eca和Ecc,根據(jù)該菌3′末端保守序列片段合成短寡聚核苷酸引物(11-mer),通過(guò)PCR擴(kuò)增出兩亞種中已知的14種基因[22],因其cDNA的逆轉(zhuǎn)錄程度較高,也進(jìn)一步說(shuō)明其cDNA的有效基因區(qū)表達(dá)程度較高。通過(guò)該方法篩選出胡蘿卜軟腐歐文菌兩個(gè)亞種的差異基因,證明其與來(lái)自于野油菜單胞菌的無(wú)毒力基因在蛋白水平上及其相似,并且通過(guò)Northern分析也進(jìn)一步證實(shí)了該差異基因[23]。此后,應(yīng)用此方法研究了胡蘿卜軟腐歐文菌并與大腸埃希菌進(jìn)行了比較分析研究[24]。

4 限制性酶切片段差異顯示

限制性酶切片段差異顯示(restriction fragment differential display PCR,RFDD-PCR)技術(shù)是在傳統(tǒng)m RNA差異顯示技術(shù)(DD-PCR)基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展而來(lái)的。RFDD-PCR不是直接擴(kuò)增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA,再在酶切后的cDNA片段兩邊加上特殊接頭進(jìn)行擴(kuò)增。正是RFDD-PCR系統(tǒng)使用了一系列特殊接頭和引物,特異性PCR引物的使用和下游的PCR反應(yīng)使RFDD-PCR分析具有高度的重復(fù)性,解決了第一代差別顯示系統(tǒng)的重復(fù)性問(wèn)題;因?yàn)镽FDD-PCR技術(shù)不使用以poly(A)為引物的PCR擴(kuò)增,因而該系統(tǒng)對(duì)原核和真核系統(tǒng)皆適用。而該技術(shù)也正由于其實(shí)用性更完善而被認(rèn)為是更加完善的第二代差異顯示系統(tǒng)。

相對(duì)于傳統(tǒng)的差異顯示技術(shù),RFDD-PCR主要具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):①最大的特點(diǎn)是由于其采用特異性配對(duì)于接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,因而其PCR具有高度的重復(fù)性而極大地降低了假陽(yáng)性率;②該方法PCR不以poly(A)為引物,使得該方法不會(huì)出現(xiàn)傳統(tǒng)PCR方法所出現(xiàn)的擴(kuò)增序列多為靠近poly(A)的非表達(dá)序列的情況[25]。因此,該技術(shù)對(duì)原核和真核系統(tǒng)都適用;③使用標(biāo)記引物來(lái)擴(kuò)增使得差異條帶的檢測(cè)更加便利、靈敏,并且每一步都設(shè)定了指標(biāo)以便檢驗(yàn)。

用該方法檢測(cè)李斯特菌抗片球菌素單核細(xì)胞基因412型變體與野生型的差異表達(dá)[26],結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變體都有3個(gè)基因片段同時(shí)表達(dá)上調(diào)。對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行改良,用5′-T25 V(V=A、C、G)引物進(jìn)行cDNA第1鏈的合成,再用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ合成cDNA第2鏈[27],純化后用TaqⅠ限切酶酶切驗(yàn)證后的雙鏈cDNA,再用T4 DNA連接酶連上接頭,選擇64個(gè)3′延伸引物中的一個(gè)和共用的標(biāo)記5′端引物配對(duì)來(lái)進(jìn)行降落PCR擴(kuò)增。最后回收凝膠片段重新PCR擴(kuò)增,雜交驗(yàn)證、測(cè)序后分析結(jié)果數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變體都有3個(gè)基因片段同時(shí)表達(dá)上調(diào)。經(jīng)過(guò)Northern雜交得到同樣的結(jié)果,進(jìn)一步證明了RFDD-PCR方法的高度重復(fù)性。

5 結(jié)語(yǔ)

基因差異表達(dá)技術(shù)的出現(xiàn)曾使生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)生了革命性的突破,這些技術(shù)在真核生物方面的研究日趨成熟,可是在原核生物領(lǐng)域的研究卻曾經(jīng)一度止步不前。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)人們不斷的對(duì)現(xiàn)有的技術(shù)加以改進(jìn);根據(jù)實(shí)際情況將多種技術(shù)相互融合,使這些技術(shù)發(fā)揮的空間不斷擴(kuò)大。由于這些技術(shù)的逐步完善,使得其在原核生物領(lǐng)域的應(yīng)用不再是個(gè)難題。上述4種技術(shù)目前都已經(jīng)成功地應(yīng)用于原核生物差異基因的研究,也為分子生物學(xué)研究開創(chuàng)了新的研究領(lǐng)域。當(dāng)然,每種方法都有其自身不足的地方,但由于其各自特有的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)開始應(yīng)用于原核生物研究領(lǐng)域,因此研究者應(yīng)根據(jù)自身研究目的,選擇合適的技術(shù)進(jìn)行研究,最大限度的發(fā)揮每種技術(shù)的特有優(yōu)勢(shì)。

[1] Rauhut R,Kluq G.mRNA degradation in bacteria[J].FEMS Microbiol Rev,1999,23(3):353-370.

[2] Sarkar N.Polyadenylation of mRNA in prokaryotes[J].Annu Rev Biochem,1997,66:173-197.

[3] Rosenow C,Saxena R M,Durst M.P rokaryotic RNA preparation methodsuseful for high density array analysis:comparison of two approaches[J].Nucleic Acids Res,2001,29(22):112.

[4] 龐 昕,周冬生,楊瑞馥.細(xì)菌mRNA的提取方法[J].生物技術(shù)通報(bào),2003(1):31-34.

[5] Li Y,Cole K,Altm an S.The effect of a single,temperatu resensitive mutation on global gene expression in Escherichia coli[J].RNA Society,2003,9:518-532.

[6] Becker P,H ufnagle W.Detection of differential gene expression in biofilm-forming versus planktonic populations of Staphy lococcusaureus using micro-represen tational-difference analysis[J].Microbiol,2001,67(7);2958-2965.

[7] Hubank M,Bryn tesson F,Regan J.Cloning of apoptosis-related genesbyrep resentational difference analysis of cNDA[J].Meth Mol Biol,2004,282:255-273.

[8] Bowler L D.Representational difference analysis of cDNA[J].M eth Mol Med,2003,94:49-66.

[9] Shan JY,Clokie M.Preparation of RNA from bacteria infected with bacteriophages:A case study from the marine unicellular Synechococcus sp.WH 7803 in fected by phage S-PM 2[J].Meth Mol Biol,2008,502:171-176.

[10] Bow ler L D,H ubank M,Spratt BG.Representational difference analysis of cDNA for the detection of differential gene expression in bacteria:development using amodel of iron-regulated gene expression in Neisseria mening itides[J].Microbiology,1999,145:3529-3537.

[11] Rebrikov D V.Identification of differential genes by suppression subtractive hybridization:an overview[J].CSH Protocols,2008:7(3):351-356.

[12] Rebrikov D V,Desai SM,Siebert PD.Suppression sub tractive hybridization[J].Meth Mol Biol,2004,258:107-134.

[13] Maranhao F C A,Paiao F G.Membrane transporter proteins are involved in Trichophytonrubrum pathogenesis[J].Med Microbiol,2009,58:163-168.

[14] Lly H O,Chan C Y,Cheng A F B.Microfluidic conductimetric bioreactor[J].Antimicrob Agents Chem other,2000,44(1):39-42.

[15] Li X Z,Zhang L,Nikaido H.Efflux pump-mediate intrinsic drug resistance in My cobacterium smegmatis.[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(7):2415-2423.

[16] De Long S K,Kinney K A.Prokaryotic suppression sub tractive hybridization PCR cDNA sub traction,a targeted method to identify differentially expressed genes[J].App Environ Microbiol,2008,74(1):225-232.

[17] Hillmann A,Dunne E,Kenny D.cDNA amplification by SMART-PCR and suppression sub tractive hy bridization(SSH)-PCR[J].Meth Mol Biol,2009,496:223-243.

[18] Vuylsteke M,Daele H.Genetic dissection of transcriptional regulation by cDNA-AFLP[J].Plant J,2006,45(3):439-446.

[19] Sarosh B R,Meijer J.T ranscripitional profiling by cDNAAFLP reveals novel insights du ring methyl jasmonate,wounding and insect attack in Brassicanapus[J].Plant Mol Biol,2007,64(4):425-438.

[20] Julia M,John G.Assessing genetic stability of a range of terrestrial micro algae after cryop reservation using amplified fragment length polym orphism(AFLP)[J].Am JBotany,2007,94:799-808.

[21] Dellagi A,Birch P R J.cDNA-AFLP analysis of differential gene expression in the prokaryotic plant pathogen Erwinia carotovora[J].Microbiology,2000,146;165-171.

[22] Shin S Y,Lee M Y,Song J H.New Erwinia-like organism causing cervical lymphadenitis[J].J Clin Microbiol,2008,46(9):3156-3158.

[23] Dubery IA.Anelici tor-and pathogen-induced cdna from potato encodes a stress-responsive cyclophilin[J].Biologia Plantarum,2007,51(2):327-332.

[24] Bell K S,Avrova A O,H oleva M C.Sample sequencing of a selected region of the genome of Erwin ia carotovora subsp.atroseptica reveals candidate phytopathogenicity genes and allow s comparison with Escherichia coli[J].Microbiology,2002,148(5):1367-1378.

[25] Yoneyam a F,Imura Y,Ohno K.Peptide-lipid huge toroidal pore,a new antimicrobial mechanism mediated by alactococcal bacteriocin,lacticin Q[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(8):3211-3217.

[26] Gravesen A,Lekkas C,Knochel S.Suface attachement of Lister ia monocytogenes is Induced by sublethal concentrations of alcohol at lowtemperatu res[J].App Environ Microbiol,2005,71(9):5601-5603.

[27] Masinde G,LiX M,Baylink D J.Isolation of w ound healing/regeneration genes using restrictive fragment differen tial display-PCR in MRL/M PJ and C57BL/6 m ice[J].Biochem Biophys Res Comm,2005,330(1):117-122.