張國鵬 蘭曉莉 陳銓 曹衛(wèi) 何勇 張永學(xué)

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，湖北省分子影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430022)

基因治療缺血性疾病已進(jìn)入臨床I-II期試驗(yàn)，并取得一定效果。但是，對于這種治療方式，缺乏理想的監(jiān)測手段。核素報(bào)告基因顯像技術(shù)為在活體水平監(jiān)測基因在體內(nèi)的表達(dá)位置、表達(dá)數(shù)量和持續(xù)時(shí)間等提供有效手段。

本文應(yīng)用以酶/底物的核素報(bào)告基因/報(bào)告探針系統(tǒng) HSV1-sr39tk/131I-FIAU，監(jiān)測治療基因表達(dá)情況。系統(tǒng)中酶底物FIAU經(jīng)核素131I標(biāo)記后，可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo) HSV1-sr39tk基因后成功表達(dá)酶蛋白，可將核素標(biāo)記酶底物磷酸化，磷酸化后的產(chǎn)物不能再次穿過細(xì)胞膜而內(nèi)陷在被感染細(xì)胞中，導(dǎo)致局部放射性濃聚。本研究中，構(gòu)建包含報(bào)告基因 HSV1-sr39tk (mutant herpes simplex virus type 1 thymidine kinase)與治療基因VEGF165(human vascular endothelial growth factor 165)的重組腺病毒載體 Ad5-sr39tk-IRES-VEGF165(Ad5-SIV)，將其感染至MSCs后，MSCs攝取報(bào)告探針131I-FIAU的情況可間接反映HSV1-sr39tk報(bào)告基因的表達(dá)情況，將細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ELISA檢測所得VEGF165蛋白分泌情況作對比分析，觀察感染病毒后 MSCs對報(bào)告探針131I-FIAU攝取與VEGF165基因表達(dá)的相關(guān)性，探索 HSV1-sr39tk報(bào)告基因監(jiān)測治療基因表達(dá)情況的可行性，為在體報(bào)告基因顯像監(jiān)測基因治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1-(2-deoxy-2-fluoro-β-D-arabinofuranosyl)-5-(tri methylstannyl)-2,4-(1H,3H)-Pyrimidinedione (FTAU)購自德國ABX公司；無載體Na131I 液體成品由北京原子能高科股份有限公司提供；Sep-Pak C-18反相色譜層析柱購自美國 Waters公司；DMEM-F12干粉培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；人淋巴細(xì)胞Ficoil分離劑購自中國天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基及Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；ITLC-SG層析紙購自美國Gelman Science公司；鼠抗人VEGF165單克隆抗體及兔抗人 TK 單克隆抗體購自美國Abcom公司；兔抗CD34、CD44多克隆抗體，SABC試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。正常SD大鼠(SPF級，雄性，150–200 g)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 Ad5-SIV的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶BglII單酶切PDC316-BMP7-IRES-VEGF165-IRES-EGFP質(zhì)粒，回收片段，利用BglII單酶切PDC316-sr39tk，回收線性化片段。將PDC316-sr39tk質(zhì)粒片段和IRES-hVEGF165目的片段通過T4 DNA連接酶作用連接起來，構(gòu)建成重組質(zhì)粒PDC316-sr39tk-IRES-VEGF165。經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定其構(gòu)建正確與否。重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定后與骨架質(zhì)粒pBHGlox_E1共感染HEK-293細(xì)胞，同源重組生成重組腺病毒Ad5-sr39tk-IRES- VEGF165(Ad5-SIV)。Ad5-SIV經(jīng)包裝鑒定及純化后測定其滴度。構(gòu)建以腺病毒包裝的Ad5- EGFP為對照組。

1.2.2 MSCs培養(yǎng)

SD大鼠麻醉后處死，75%酒精中浸泡20 min，無菌條件下剪開股骨及脛骨干骺端，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，將骨髓沖洗液加至裝有密度為1.077的Ficoll分離劑的離心管中，使液面分界清楚，細(xì)胞懸液和離心液的體積比為1:1–1:2，采用密度梯度離心法，收集單核細(xì)胞層，含15%GIBCO胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，吹打均勻后將細(xì)胞以3×105/mL密度接種于25 cm2玻璃培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3–4 d后首次換液，之后每3天換液1次。細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)70%–80%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。收集第四代細(xì)胞用CD34、CD44抗體免疫組織化學(xué)染色鑒定細(xì)胞。

1.2.3 Ad5-SIV感染MSCs

取2–4代MSCs細(xì)胞2×105/孔接種于24孔板，細(xì)胞融合度達(dá)70%–80%后，取3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余孔棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞2遍，每孔加入無血清培養(yǎng)基Opti-MEM 150 μL(蓋滿細(xì)胞表面即可)，將特定感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)的Ad5-SIV及Ad5-EGFP加入培養(yǎng)孔，混勻，每15 min搖動(dòng)一次，37℃感染2 h，補(bǔ)足完全培養(yǎng)基至需求量，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 免疫激光共聚焦監(jiān)測 HSV1-sr39tk蛋白與VEGF165蛋白表達(dá)

取用第4代MSCs制備細(xì)胞爬片，感染Ad5-SIV后48 h，感染滴度為MOI=100。PBS (0.01 mol/L，pH 7.2) 沖洗兩遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.5%Triton X-100破膜10 min，5%BSA封閉1.5 h，抗體稀釋液稀釋的鼠抗人 VEGF165單克隆抗體工作液(1:100)與兔抗人 TK蛋白單克隆抗體工作液(1:100)制成混合液，將混合液滴加到細(xì)胞爬片上，4℃孵育過夜，隨后加入 1:100二抗混合液(FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG 與CY3標(biāo)記的羊抗兔IgG)，37℃孵育1 h，Hoechst33342復(fù)染細(xì)胞核，漂洗、封片。以未感染病毒細(xì)胞為對照，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察兩種蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 細(xì)胞感染 Ad5-SIV后 ELISA檢測VEGF165蛋白分泌

Ad5-SIV以感染復(fù)數(shù)(MOI=0、10、25、50、75、100 IU/per cell)感染MSCs，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心去除細(xì)胞碎片，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后在450 nm條件下用酶標(biāo)儀測量每孔計(jì)數(shù)，用CurveExpert 1.3軟件計(jì)算培養(yǎng)上清VEGF165蛋白含量。

1.2.6131I-FIAU的制備與純化

FTAU為合成FIAU的前體，經(jīng)131I標(biāo)記后，形成131I-FIAU。標(biāo)記過程如下[1]：FTAU溶于甲醇制成5 mg/mL溶液，將其分裝為每EP管50 μL。將40 μL 0.1 mol/L HCL 加入 100 μL131I-NaI(185 MBq)溶液，與50 μL FTAU甲醇溶液振蕩混勻～20 s，加入30%H2O2/CH3CO2H(1:3)約20 μL至EP管，振蕩混勻30 s，室溫靜置約3 min，再加入100 μL偏重亞硫酸鈉(Na2S2O5)飽和溶液終止反應(yīng)。標(biāo)記產(chǎn)物用Sep-Pak C-18反向色譜層析柱分離純化，洗脫液為甲醇。將131I-FIAU峰管點(diǎn)樣于ITLC-SG層析紙，以V(乙酸乙酯):V(丙酮):V(水)=12:8:1混合液為展開劑層析測量其放化純。標(biāo)記物于室溫放置 6、12、24 h，觀察其體外穩(wěn)定性。

1.2.7 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

(1) 時(shí)間相關(guān)攝取實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組為Ad5-SIV感染細(xì)胞組(MOI=50)，對照組為Ad5-EGFP感染細(xì)胞組(MOI=50)。病毒感染 MSCs后48 h進(jìn)行攝取131I-FIAU實(shí)驗(yàn)，每孔細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入300 μL 新鮮培養(yǎng)基。隨之每孔加入131I-FIAU 370 kBq，37℃分別孵育 30、60、90、120、150、180、240 min后取樣(每時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)平行孔)。取樣時(shí)吸去每孔中放射性培養(yǎng)基，用 PBS洗滌 2次，以 1 mol/L NaOH溶液400 μL裂解貼壁細(xì)胞，收集各孔放射性培養(yǎng)基及細(xì)胞裂解產(chǎn)物至測量管，用γ計(jì)數(shù)儀測量各管的放射性，計(jì)算細(xì)胞攝取率Uptake% =細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)/(細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)+培養(yǎng)液計(jì)數(shù))×100%。(2) 病毒MOI相關(guān)攝取實(shí)驗(yàn)：用Ad5-SIV和Ad5-EGFP按照 MOI=0、10、25、50、75、100分別感染細(xì)胞，48 h后每孔加入370 kBq131I-FIAU，37℃培養(yǎng)3 h進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，其余步驟同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Ad5-SIV的構(gòu)建

不同組合酶切鑒定分析證實(shí)pDC316-sr39tk-IRES-VEGF165重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，所得腺病毒產(chǎn)物純化后滴度達(dá)7.9×109U/mL(TCID50法，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)，對照組病毒 Ad5-EGFP滴度為1.4×1010U/mL。

2.2 MSCs 培養(yǎng)及鑒定

細(xì)胞接種24 h后開始貼壁，細(xì)胞呈圓形，3–4天后形態(tài)向短梭形或短棒狀轉(zhuǎn)變。一周左右細(xì)胞呈梭形，放射狀或同心圓狀排列，兩周左右長滿瓶底。細(xì)胞傳代后形態(tài)呈梭形，較為均一。取第4代MSCs免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：MSCs CD34抗體染色陰性，而CD44抗體染色陽性(圖1)。

圖1 MSCs (P4)免疫組織化學(xué)方法鑒定結(jié)果(a) 光鏡下觀察第4代細(xì)胞，可見細(xì)胞呈梭形，放射狀排列，(b) PBS代替一抗作為陰性對照，(c) CD34抗體染色細(xì)胞內(nèi)未見明顯棕褐色顆粒，(d) CD44抗體染色大部分細(xì)胞內(nèi)可見棕褐色顆粒Fig.1 Immunocytochemical staining of the4th passage MSCs.(a) The normal cells in fibroblast-like appearance were uniformly distributed, (b) The negative control, (c) Surface antigens expressed in cells were negative for CD34, (d) Surface antigens expressed in cells were positive for CD44.

2.3 病毒感染后共聚焦顯微鏡監(jiān)測免疫熒光結(jié)果

Ad5-SIV以MOI=100滴度感染MSCs后，通過免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測 VEGF165蛋白及HSV1-sr39tk蛋白在MSCs中的表達(dá)。如圖2，激光共聚焦顯微鏡下可見感染Ad5-SIV組MSCs胞漿中有 VEGF165(紅色熒光)及 HSV1-sr39tk蛋白表達(dá)(綠色熒光)，而未感染病毒組胞漿則未觀察到紅色及綠色熒光，僅有藍(lán)色HOCHEST核染色。由此證明，Ad5-SIV可在MSCs細(xì)胞中成功感染且可正常表達(dá)VEGF165及HSV1-sr39tk蛋白。

2.4 VEGF蛋白分泌與HSV1-sr39tk蛋白酶活性間相關(guān)性分析

ELISA結(jié)果證實(shí)VEGF165蛋白分泌隨病毒滴度增加，二者呈線性正相關(guān)(圖3，P<0.05)，也即Ad5-SIV感染MSCs后VEGF165蛋白可正常表達(dá)及分泌。

2.5 131I-FIAU的制備

標(biāo)記產(chǎn)物經(jīng)純化后可見兩個(gè)放射性計(jì)數(shù)峰，第2峰為131I-FIAU，標(biāo)記率為(86.19±2.2)%，經(jīng)ITLC-SG層析測定放化純?yōu)?94.16±2.93)%，標(biāo)記物放置6、12、24 h后，放化純均≥90%，說明標(biāo)記物體外穩(wěn)定。

圖2 免疫熒光激光共聚焦檢測結(jié)果, 上層為Ad5-SIV感染細(xì)胞組，下層為未感染病毒細(xì)胞組結(jié)果Fig.2 Results of immunofluorescence.The upper and lower layers are Ad5-SIV-infected and non infected cells, respectively.

圖3 VEGF165蛋白分泌與病毒MOI間相關(guān)性分析Fig.3 Relationship of VEGF165 secretion and MOI.

2.6 細(xì)胞感染Ad5-SIV后不同滴度及不同時(shí)間攝取131I-FIAU的實(shí)驗(yàn)研究

時(shí)間相關(guān)攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4a)顯示，隨時(shí)間延長，感染Ad5-SIV組細(xì)胞攝取率逐步升高，150 min后細(xì)胞攝取率升高緩慢，150 min攝取率為(20.06±1.33)%，實(shí)驗(yàn)組與對照組攝取率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異顯著(t=18.43–54.83, P<0.05)。

病毒MOI相關(guān)攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞攝取率隨MOI增加(圖4b)，二者間呈線性正相關(guān)(圖4c，P<0.05)，除 MOI為 0組外，感染 Ad5-SIV與Ad5-EGFP兩組的攝取率之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.91–16.83，P<0.05)。

圖4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果(a) 時(shí)間相關(guān)攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，(b) 感染復(fù)數(shù)相關(guān)攝取結(jié)果，(c)攝取率與感染復(fù)數(shù)相關(guān)性分析Fig.4 Results of the cellular uptake of 131I-FIAU.(a) Cellular uptake of 131I-FIAU vs time, (b) Cellular uptake of 131I-FIAU vs MOI,(c) Relationship between the 131I-FIAU uptake rate and MOI

2.7 VEGF165蛋白分泌與HSV1-sr39tk酶蛋白活性相關(guān)性分析

攝取結(jié)果反映HSV1-sr39tk酶的功能活性，ELISA結(jié)果反映VEGF165蛋白的表達(dá)及分泌情況，不同 MOI病毒感染后，ELISA結(jié)果與攝取結(jié)果作相關(guān)性分析，可間接反映VEGF165蛋白及HSV1-sr39tk酶活性間關(guān)系(圖5)，可見二者間呈線性正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

因VEGF強(qiáng)大的促進(jìn)血管新生作用，基因治療在缺血性疾病治療臨床I、II期試驗(yàn)中已獲得良好效果[2,3]，但是，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)VEGF作用產(chǎn)生的血管通透性增加，導(dǎo)致血管源性水腫及血管瘤產(chǎn)生[4]。這些均由于缺乏對治療基因表達(dá)程度、持續(xù)時(shí)間、表達(dá)位置等有效監(jiān)測。

圖5 VEGF165蛋白分泌與HSV1-sr39tk酶蛋白活性相關(guān)分析結(jié)果Fig.5 Relationship of VEGF165 secretion and HSV1-sr39tk activity.

分子影像是一種有效的監(jiān)測手段[5]，在分子影像中，與直接分子影像需合成針對性顯像探針相比，報(bào)告基因顯像由于其并不改變所研究系統(tǒng)的生物學(xué)過程，報(bào)告探針無需重新合成而有利于廣泛推廣[6]。放射性核素報(bào)告基因顯像靈敏度高、可重復(fù)性好、無創(chuàng)性及可定量分析，是最合適的顯像技術(shù)[7]。目前核素報(bào)告基因主要包括：酶-底物系統(tǒng)、受體-配體系統(tǒng)、轉(zhuǎn)運(yùn)體-底物系統(tǒng)等[8–10]。

酶/底物報(bào)告基因顯像系統(tǒng)中，I型單純皰疹病毒胸腺激酶基因(HSV1-tk)是目前應(yīng)用最廣的報(bào)告基因[11]，本研究采用突變單純皰疹病毒 tk基因(HSV1-sr39tk)，該基因編碼的酶與野生型 HSV1-tk編碼的酶相比，對底物的磷酸化作用更強(qiáng)[12]。

內(nèi)部核糖體切入位點(diǎn)(Internal Ribosomal Entry Site, IRES)是一種不依賴5 端帽的結(jié)構(gòu)，其優(yōu)勢在于所連接的雙基因可在同一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下于同一條mRNA上翻譯，其上下游兩種基因可獨(dú)立表達(dá)，表達(dá)水平可保持恒定比例。研究中，利用該技術(shù)將報(bào)告基因HSV1-sr39tk與治療基因VEGF165連接起來，構(gòu)建成功Ad5-sr39tk-IRES-VEGF165。

免疫激光共聚焦顯微鏡下可觀察到病毒感染后，報(bào)告基因HSV1-sr39tk及治療基因VEGF165均可在MSCs中成功表達(dá)。滴度相關(guān)攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，攝取率與病毒滴度呈正相關(guān)關(guān)系，表明HSV1-sr39tk酶活性與病毒滴度間表達(dá)具有很好的相關(guān)性。ELISA結(jié)果顯示，不同 MOI感染 MSCs后 VEGF165蛋白的分泌呈逐步增高趨勢，VEGF165蛋白分泌量與病毒感染復(fù)數(shù)間亦具有較好的相關(guān)性。這些結(jié)果表明，Ad5-SIV感染后，HSV1-sr39tk及VEGF165蛋白均可獨(dú)立表達(dá)，表達(dá)程度均與病毒的感染復(fù)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。

將不同感染復(fù)數(shù)攝取結(jié)果與 ELISA結(jié)果作相關(guān)性分析，二者之間具有較好的相關(guān)性，由此說明病毒感染后HSV1-sr39tk酶活性與VEGF165蛋白分泌間具有較好相關(guān)性?？梢酝普?，通過HSV1-sr39tk基因的表達(dá)可間接反映 VEGF165蛋白的表達(dá)，HSV1-sr39tk/FIAU報(bào)告基因系統(tǒng)可被用來監(jiān)測治療基因。

本研究闡明了 IRES連接的報(bào)告基因及治療基因間表達(dá)具有較好的相關(guān)性，但是 IRES載體下游基因的表達(dá)較上游基因表達(dá)減弱，可在實(shí)際基因治療中，根據(jù)基因治療效果要求與報(bào)告顯像的靈敏度要求來選擇兩者的位置或通過構(gòu)建“super-IRES”來增加下游基因的表達(dá)[13]。

本研究中使用了腺病毒載體，盡管腺病毒載體制備簡易、感染效率高、攜帶 DNA容量較大[11]，但是其并不能整合入宿主染色體中，不能穩(wěn)定長期表達(dá)，因而不利于報(bào)告基因顯像長期監(jiān)測治療效果。我們采用MSCs細(xì)胞，由于其具有多向分化功能，也可以用作治療。故本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用報(bào)告基因顯像監(jiān)測治療基因的同時(shí)也可對感染細(xì)胞的情況作實(shí)時(shí)監(jiān)測，為細(xì)胞/基因聯(lián)合治療的監(jiān)測提供了體外研究依據(jù)[14]。

本研究成功構(gòu)建了重組腺病毒系統(tǒng)Ad5-SIV，通過體外研究證實(shí)感染 Ad5-SIV的 MSCs細(xì)胞對131I-FIAU攝取與 VEGF165表達(dá)呈正相關(guān)。說明HSV1-sr39tk/FIAU報(bào)告基因系統(tǒng)可被用來監(jiān)測治療基因VEGF165表達(dá)，為進(jìn)一步的活體核素報(bào)告基因顯像提供了理論支持。

致謝 本課題中病毒構(gòu)建及鑒定由北京北元正陽基因技術(shù)股份有限公司合作完成，在此表示感謝。

1 Vaidyanathan G, Zalutsky M R.Nucl Med Biol, 1998,25(5):487–496

2 Wu J C, Bengel F M, Gambhir S S.Radiology, 2007,244(2): 337–355

3 Kilarski W W, Samolov B, Petersson L, et al.Nat Med,2009, 15(6): 657–664

4 Peters S, Cree I A, Alexander R, et al.Cytokine, 2007,40(2): 144–150

5 Tran T D, Caruthers S D, Hughes M, et al.Int J Nanomedicine, 2007, 2(4): 515–526

6 Wu J C, Bengel F M, Gambhir S S.Radiology, 2007,244(2): 337–355

7 Acton P D, Zhou R.Q J Nucl Med Mol Imaging, 2005,49(4): 349–360

8 Chin F T, Namavari M, Levi J, et al.Mol Imaging Biol,2008, 10(2): 82–91

9 Aung W, Okauchi T, Sato M, et al.Nucl Med Commun,2005, 26(3): 259–268

10 Shin J H, Chung J K, Kang J H, et al.Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2004, 31(3):425–432

11 Lan X, Yin X, Wang R, et al.Nucl Med Biol, 2009, 36:207–213

12 Gambhir S S, Bauer E, Black M E, et al.A mutant herpes simplex virus type 1 thymidine kinase reporter gene shows improved sensitivity for imaging reporter gene expression with positron emission tomography, Proc Natl Acad Sci.USA, 2000, 97: 2785–2790

13 Chen I Y, Wu J C, Min J J, et al.Circulation, 2004,109(11): 1415–1420

14 Willmann J K, Paulmurugan R, Rodriguez-Porcel M, et al.Radiology, 2009, 252(1): 117–127