張海悅，徐 鶴，王 蕾

(長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林 長春 130012)

黑葵花籽殼紅色素的純化及主要成分結(jié)構(gòu)鑒定

張海悅，徐 鶴，王 蕾

(長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林 長春 130012)

選用8種大孔樹脂對黑色葵花籽殼紅色素進行純化，結(jié)果表明，AB-8大孔吸附樹脂最適合于色素的分離純化，且通過靜態(tài)吸附與解吸實驗確定了最佳純化的條件，純化后色價提高5倍，再經(jīng)冷凍干燥得到了色素的精制品。定性分析及紅外圖譜、薄層色譜、高效液相色譜及質(zhì)譜分析表明，葵花籽殼紅色素為花色苷類色素，且主要成分為矢車菊-3-葡萄糖苷。

黑葵花籽；紅色素；純化；結(jié)構(gòu)

天然色素與人工合成色素相比，具有安全性高，無副作用，色調(diào)自然的優(yōu)點，天然色素中含有一些人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)如類胡蘿卜素、黃酮類天然色素等，還具有一定的藥理功效。天然紅色素作為天然色素中的一大類，對其的開發(fā)也是必不可少的。但是多數(shù)天然紅色素穩(wěn)定性較差，致使不法分子將工業(yè)合成染色劑添加到食品中，對人的健康造成嚴重影響。因此，開發(fā)穩(wěn)定、安全無害的天然紅色素是非常必要的[1]。

我國(特別是東北地區(qū))黑葵花籽資源十分豐富。從農(nóng)產(chǎn)品的廢棄物——黑葵花籽殼中提取天然紅色素，有利于農(nóng)產(chǎn)品的深加工以及廢棄物的處理，是葵花籽增值的又一新途徑[2]。

我國對天然色素的研究起步較晚，目前對葵花籽殼色素的研究報道較少，暫無對其純化方法及結(jié)構(gòu)鑒定的綜合性報道。傳統(tǒng)的方法對色素的提取率較低，得到的產(chǎn)品色價也很低，無法應(yīng)用到實際生產(chǎn)中[3]。本實驗通過AB-8大孔樹脂對色素進行純化，并采用冷凍干燥處理，以得到純度較好、色價較高的葵花籽殼紅色素，旨在為進一步開發(fā)其功能性產(chǎn)品提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑色葵花籽購于長春本地，去仁留殼備用。

石油醚 天津化學試劑有限公司；鹽酸 北京化工廠；乙酸乙酯 哈爾濱市新達化工廠；無水乙醇 淄博市臨淄云天化工廠，以上試劑均為分析純；氯仿(化學純)、氯化鈉(無水，分析純) 開原市化學試劑一廠；甲醇、乙腈(色譜純) 美國Agilent公司；薄層層析硅膠(化學純) 青島市市北區(qū)?；稍飫S；矢車菊-3-葡糖苷標品 天津一方科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

721型分光光度計 上海第三分析儀器廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；ARATVA-360型紅外光譜儀 美國Perkin Elmer公司；Agilent 1100 LC/ MSD TRAP 離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent公司；LGJ-30冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色素的提取

取1000g葵花籽殼，先用石油醚脫脂兩次，之后用6倍體積的50%乙醇溶液在60℃下水浴浸提取1h，提取3次，合并濾液，過濾濃縮后，濃縮液經(jīng)1/3倍體積的無水乙醇萃取，得萃取液500mL[4]。

1.3.2 色素的純化

1.3.2.1 靜態(tài)實驗

大孔樹脂對不同的物質(zhì)具有不同的吸附性能，通過測定靜態(tài)時樹脂對葵花籽殼紅色素的吸附率，來考察樹脂對色素的吸附容量，從而選擇合適的樹脂分離色素[5]。

根據(jù)文獻報道，目前天然產(chǎn)物化學成分分離中最常用的樹脂有D-101、DA-201、AB-8、H-103、LD-605、CDA-40、D-1300、NKA-9等。本實驗選取這8種不同的大孔吸附樹脂，經(jīng)預(yù)處理后，每份0.2g，分別置于20mL葵花籽殼紅色素原液(1.3.1節(jié)所得無水乙醇萃取液)中，室溫放置12h分別測定吸附前后樣品在波長520nm處的吸光度，計算靜態(tài)吸附率和解吸率[6]。

式中：A0為初始色素液吸光度；A1為清液吸光度；A2為洗脫液吸光度。

1.3.2.2 動態(tài)實驗

取靜態(tài)吸附實驗選出的AB-8樹脂，預(yù)處理濕法裝入4cm×50cm吸附柱中，樹脂高16cm，即約50mL樹脂。取原液直接上樣。對色素進行進一步的研究。

1.3.3 色價的變化

色價是指單位質(zhì)量原料提取物的吸光度，在不同程度上可以反映物質(zhì)的純度變化，越大表示物質(zhì)越純[7]。

不同純化程度色價的比較：采用分光光度法，比色皿lcm，測定樣品質(zhì)量濃度為1g/100mL，波長520nm處的吸光度A520nm即為葵花籽殼紅色素的色價，用表示。取色素粗提和樹脂提純后色素固體各1.0g，溶于100mL蒸餾水中，測其E1c%m，比較色素液吸附前后色價的變化。

1.3.4 色素的成分分析

經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化后的色素，再經(jīng)濃縮、冷凍干燥處理后，進行下一步實驗。

1.3.4.1 顏色反應(yīng)

移取多份等量色素，將其溶于10倍體積的蒸餾水中，通過在可見光下、紫外光下、硫酸介質(zhì)中、Mg2+鹽酸介質(zhì)中、FeCl3溶液中、AlCl3溶液中等條件下處理色素，觀察葵花籽殼色素的變化[8]。

1.3.4.2 Francis法測定A440nm/Amax

通過測定色素Amax/A440nm值來判斷其為單一糖苷還是雙糖苷[9]。

1.3.4.3 糖組成的測定

用1mol/L鹽酸在100℃條件下水解葵籽殼紅色素的組分1h，鹽酸與色素體積比為2:1。取出后用冰水速冷，取褐色溶液，再用正戊醇萃取至水層無色，將水層濃縮后進行薄層層析，晾干后用顯色劑顯色，對照為葡萄糖，觀察是否有棕色斑點生成，且計算比移值[10-11]。

展開劑：正丙醇、水體積比為8:2。

顯色劑為聯(lián)苯胺試劑：將體積分數(shù)為0.5%的聯(lián)苯胺溶于20mL冰乙酸中，加入無水乙醇80mL，混合均勻，即得到聯(lián)苯胺試劑。顯色時，將其噴在薄層上，于100～150℃加熱15min，使還原糖生成棕色色斑。

1.3.5 葵花籽殼紅色素的主要成分結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.5.1 紅外光譜的檢測

采用溴化鉀壓片法：將溴化鉀結(jié)晶塊在瑪瑙研缽中研成細粉，稱取200mg溴化鉀粉末2份，一份加入色素樣品2mg研細混勻，另一份作為空白用以扣除本底，分別進行壓片，在500～4000cm-1范圍內(nèi)測其紅外吸收光譜[12]。

1.3.5.2 高效液相色譜

色譜柱：Hypersil ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：A，水(0.5%三氟乙酸)；B，乙腈(0.5%三氟乙酸)；梯度：0～10min，10%～18%B加入A中(線性)；10～18min，18%～28% B加入A中(線性)；18～19min，28%～40% B加入A中(線性)；19～22min，40%～60% B加入A中(線性)；22～23min，60%～10% B加入A中(線性)；23～28min，10% B加入A中(等梯度)；流速：1mL/min；檢測波長：520nm和280nm[13]。

1.3.5.3 質(zhì)譜

正離子掃描(ESI+，m/z100～1000)，干燥氣流為10 L/min，噴霧器壓力為50Pa，干燥氣溫為325℃。

樣品經(jīng)甲醇溶解、濾膜過濾后，上柱檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的選擇

8種大孔樹脂的靜態(tài)吸附結(jié)果見表1。結(jié)果表明，AB-8樹脂的效果最好，所以選取其進行動態(tài)實驗。

表1 不同樹脂對色素的吸附結(jié)果Table 1 Absorption ratios of 8 kinds of macroporous resins towards the pigment

2.2 動態(tài)實驗

本實驗選取乙醇為洗脫劑。上樣量為50mL，質(zhì)量濃度為1mg/mL，上樣流速為3mL/min，洗脫速度為1.5mL/min。

2.2.1 不同體積分數(shù)乙醇溶液對解吸效果的影響

圖1 乙醇體積分數(shù)對解吸效果的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the desorption of the pigment

分別用不同體積分數(shù)的乙醇溶液200mL進行洗脫，由圖1可以看出，當乙醇體積分數(shù)為70%時對色素的解吸效果最佳。因此，采用70%的乙醇溶液為色素解吸液。

2.2.2 色素溶液pH值對樹脂吸附率的影響

表2 不同pH值對吸附率的影響Table 2 Effect of environmental pH on the adsorption of the pigment

表2中列出了pH值在2.0～4.0范圍內(nèi)，AB-8大孔樹脂對葵籽殼色素的吸附率。色素溶液在pH2.5時，AB-8大孔樹脂對其的吸附率最高，因此在色素吸附時采用pH2.5的提取液為最佳。

2.2.3 色素的解吸曲線

圖2 不同乙醇用量對解吸效果的影響Fig.2 Effect of ethanol amount on the desorption of the pigment

將上述吸附飽和的樹脂用70%乙醇溶液進行解吸，繪制色素的解吸曲線如圖2所示。由該曲線可看出，色素解吸速度較快，僅用少量的解吸液即可使色素從樹脂上解吸下來。其用量約為5倍上樣量，且此時的解吸率達到79.46%。

2.2.4 色價比較結(jié)果

表3 色價比較結(jié)果Table 3 Comparison of color values of the pigment before and after AB-8 type resin purification

由表3可知，樹脂提純后產(chǎn)品純度較高，色素色價提高5倍以上，色價遠高于粗制品，且極易成粉。

2.3 色素的成分分析

2.3.1 顏色反應(yīng)

將葵花籽殼紅色素經(jīng)物理或化學處理，觀察其顏色變化，結(jié)果如表4所示。

表4 色素的顏色反應(yīng)Table 4 Color reaction of the pigment

表4與植物色素標準顏色反應(yīng)比較，可以得出定性的結(jié)果，葵花籽殼紅色素屬于黃酮類花色苷化合物。

2.3.2 Francis法測A440nm/Amax

根據(jù)Francis的結(jié)論。即單一花色苷(3號位置)在0.1%HCl-甲醇溶液中，其A440nm/Amax百分比值一般大于20；而雙取代的花色苷(3、5號位置)在0.1%HCl-甲醇溶液中A440nm/Amax百分比值一般為10～20。通過這一比值可以推斷在3號位和5號位是否帶有糖苷鍵。對色素測其可見光區(qū)最大吸收波長的吸光度和波長440nm處的吸光度，再求兩個吸光度的比值(%)。結(jié)果見表5。

表5 色素的A440nm/AmaxTable 5 A440nm/Amax of the pigment

由表5可以推測，色素為單一花色苷，即3位糖苷的花色苷衍生物。

2.3.3 薄層色譜(TLC)檢識

圖3 色素完全水解薄層色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of the final hydrolysis product of the pigment

由圖3可得出色素完全水解后糖組成的Rf值，其計算結(jié)果見表6。

表6 色素組分完全水解后薄層層析的Rf×100值Table 6 One hundred-fold enlarged Rf values of the final hydrolysis product of the pigment in TLC

由表6可見，色素完全水解后，生成葡萄糖。為考察葡萄糖是以單糖還是雙糖方式在糖苷配基上，有必要對色素進行部分水解。色素在水解5min時，無斑點顯示，水解10min乃至最后，一直顯示一個斑點，該斑點的Rf值與葡萄糖的Rf值基本一致(其差值0.01可能是人工操作帶來的誤差，且在可接受范圍內(nèi))。因此，推測色素的糖配基是由葡萄糖這個單糖組成的。

表7 不同水解時間薄層層析的Rf值Table 7 One hundred-fold enlarged Rf values of the hydrolysis products of the pigment at various hydrolysis time points in TLC

2.4 葵花籽殼紅色素主要成分的結(jié)構(gòu)鑒定

2.4.1 紅外光譜檢測結(jié)果

圖4 葵花籽殼紅色素的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of the pigment

由圖4可見，3391cm-1可能是羥基伸縮振動吸收峰，1276cm-1可能是羥基C－O伸縮振動吸收峰；1729cm-1可能是C＝O 鍵伸縮振動吸收峰；1607、1482cm-1可能是苯環(huán)吸收峰，綜上所述，樣品主要吸收為苯環(huán)、羥基的特征吸收峰。

2.4.2 高效液相色譜檢測結(jié)果

圖5 花色苷標準品高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of anthocyanin standard

圖6 葵花籽殼紅色素樣品高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of the pigment

由圖5、6可知，樣品與花色苷標準品在檢測條件一致狀態(tài)下出峰時間相同，都為6min，說明樣品中存在花色苷。但樣品中還含有其他物質(zhì)，僅以現(xiàn)有條件難以分離，且性質(zhì)與矢車菊-3-葡萄糖苷性質(zhì)相似，可能也為花色苷類物質(zhì)，有待于進一步的研究。

2.4.3 質(zhì)譜檢測結(jié)果

圖7 花色苷標準品質(zhì)譜圖Fig.7 MS spectrum of anthocyanin standard

圖8 葵花籽殼紅色素樣品質(zhì)譜圖Fig.8 MS spectrum of the pigment

由圖7、8可知，正離子掃描的m/z 449[M+H]+峰，碎片離子m/z 287峰，是由m/z 449失去一個質(zhì)量數(shù)162 (六碳糖基)中性碎片所得，樣品的質(zhì)譜圖中明顯顯示了此特征峰值，與標準品相一致，且與報道相一致[14]，進一步說明了黑葵花籽殼紅色素主要成分為矢車菊-3-葡萄糖苷。

通過高效液相色譜圖和質(zhì)譜圖表明：與標準品對照及查閱有關(guān)文獻可知葵花籽殼紅色素其主要成分為矢車菊-3-葡萄糖苷。黑葵花籽殼紅色素并不是由矢車菊-3-葡萄糖苷這種單一成分所組成的，但其性質(zhì)與其相似，有待于進一步的分離及研究。

3 結(jié) 論

對葵花籽殼紅色素的純化方法進行了研究。采用大孔吸附樹脂吸附黑葵花籽殼紅色素，在對比的8種樹脂中，AB-8大孔吸附樹脂對色素吸附力極強，故選擇其為動態(tài)實驗樹脂。其吸附條件中：原料液pH值為2.5，吸附流速3mL/min；其洗脫條件中：洗脫劑(乙醇)體積分數(shù)對洗脫效果有較大影響，最佳洗脫體積分數(shù)為70%，洗脫流速為1.5mL/min，洗脫量為250mL。

對葵花籽殼紅色素定性分析，通過色素在不同pH值下的光譜特征、顏色變化和色素在經(jīng)過不同方法處理后的顏色及薄層層析結(jié)果，以及紅外光譜、高效液相色譜圖及質(zhì)譜圖得出葵花籽殼紅色素應(yīng)為黃酮類花色苷化合物，且主要成分為矢車菊-3-葡萄糖苷。而且色素中還含有其他花色苷類成分，有待進一步的鑒定。

[1] 王蕾, 張海悅, 白雪麗, 等. 葵花籽資源在食品工業(yè)中的新開發(fā)[J].食品科技, 2007(10): 7-9.

[2] 徒曉茜. 天然色素的提取與分離[J]. 印染助劑, 2006, 23(9): 37-40.

[3] 曾順德, 漆巨容, 張迎君. 天然食用色素的提取、純化及應(yīng)用[J]. 食品研究與開發(fā), 2004, 25(6): 79-81.

[4] 張海悅, 王蕾. 葵花籽殼色素的提取及穩(wěn)定性研究[J]. 中國釀造, 2009 (7): 72-74.

[5] 孫健, 蔣躍明, 彭子模. 利用大孔吸附樹脂提取蜀葵花色素的研究[J]. 生物技術(shù), 2005, 15(1): 64-65.

[6] 陳玉瓊, 李安琪, 孟燕. 大孔樹脂純化藤茶黃酮及主要成分結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 食品科學, 2009, 30(9): 51-55.

[7] 張秀麗, 李勁濤, 楊軍. 植物花色苷定性定量研究方法[J]. 西華師范大學學報: 自然科學版, 2006, 27(3): 300-303.

[8] 徐淵金, 杜淇珍. 花色苷分離鑒定方法及其生物活性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(3): 67-71.

[9] 姜平平, 呂曉玲, 朱惠麗.花色苷類物質(zhì)分離鑒定方法[J]. 中國食品添加劑, 2003(4): 108-111.

[10] 劉琬暉, 嚴銘銘, 趙大慶. 硅膠薄層層析展開劑構(gòu)成的變化對不同極性成分Rf值的影響[J].長春中醫(yī)藥大學學報, 2007(3): 20-21.

[11] 楊志, 張芳, 李梅. 梔子藍色素制備及純化工藝的研究[J]. 河南工業(yè)大學學報: 自然科學版, 2008, 29(2): 59-63.

[12] 林賢福.現(xiàn)代波譜分析方法[M].上海:華東理工大學出版社, 2009: 4-56.

[13] 夏效東, 凌文華, 鄭琳. HPLC法測定黑米皮提取物中花色苷成分及含量[J]. 食品科學, 2006, 27(2): 206-207.

[14] 樊金玲, 朱文學, 沈軍衛(wèi), 等. 高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法分析牡丹花中花色苷類化合物[J]. 食品科學, 2007, 28(8): 367-371.

Purification and Structural Identification of the Major Component of the Red Pigment from Black Sunflower Seed Shell

ZHANG Hai-yue，XU He，WANG Lei
(College of Chemical and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China)

Eight kinds of macroporous adsorption resins were used for the static adsorption of the red pigment extract from black sunflower seed shell, and AB-8 type resin presented the highest adsorption ratio and was consequently selected for further investigations. The optimum conditions for the dynamic adsorption and desorption of the pigment extract were explored. After purification using AB-8 type resin under the optimized adsorption and desorption conditions, a 5-fold elevation in the color value of the pigment extract was obtained. Lyophilization gave a crystallized red pigment. The major components of the red pigment was identified to be ascyanidin-3-glucoside through qualitative tests and IR spectroscopic, thin layer chromatographic, HPLC and MS analyses.

black sunflower seed shell；red pigment；purification；structure

TS202.3

A

1002-6630(2010)17-0036-05

2010-01-20

吉林省教育廳重點項目(吉教科合字[2006]第61號)

張海悅(1967—)，女，副教授，碩士，主要從事功能食品及農(nóng)副產(chǎn)品的深加工研究。E-mail：zhhaiyue@163.com