張海悅，徐 鶴，王 蕾

(長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

黑葵花籽殼紅色素的純化及主要成分結(jié)構(gòu)鑒定

張海悅，徐 鶴，王 蕾

(長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

選用8種大孔樹(shù)脂對(duì)黑色葵花籽殼紅色素進(jìn)行純化，結(jié)果表明，AB-8大孔吸附樹(shù)脂最適合于色素的分離純化，且通過(guò)靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)確定了最佳純化的條件，純化后色價(jià)提高5倍，再經(jīng)冷凍干燥得到了色素的精制品。定性分析及紅外圖譜、薄層色譜、高效液相色譜及質(zhì)譜分析表明，葵花籽殼紅色素為花色苷類色素，且主要成分為矢車菊-3-葡萄糖苷。

黑葵花籽；紅色素；純化；結(jié)構(gòu)

天然色素與人工合成色素相比，具有安全性高，無(wú)副作用，色調(diào)自然的優(yōu)點(diǎn)，天然色素中含有一些人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如類胡蘿卜素、黃酮類天然色素等，還具有一定的藥理功效。天然紅色素作為天然色素中的一大類，對(duì)其的開(kāi)發(fā)也是必不可少的。但是多數(shù)天然紅色素穩(wěn)定性較差，致使不法分子將工業(yè)合成染色劑添加到食品中，對(duì)人的健康造成嚴(yán)重影響。因此，開(kāi)發(fā)穩(wěn)定、安全無(wú)害的天然紅色素是非常必要的[1]。

我國(guó)(特別是東北地區(qū))黑葵花籽資源十分豐富。從農(nóng)產(chǎn)品的廢棄物——黑葵花籽殼中提取天然紅色素，有利于農(nóng)產(chǎn)品的深加工以及廢棄物的處理，是葵花籽增值的又一新途徑[2]。

我國(guó)對(duì)天然色素的研究起步較晚，目前對(duì)葵花籽殼色素的研究報(bào)道較少，暫無(wú)對(duì)其純化方法及結(jié)構(gòu)鑒定的綜合性報(bào)道。傳統(tǒng)的方法對(duì)色素的提取率較低，得到的產(chǎn)品色價(jià)也很低，無(wú)法應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)色素進(jìn)行純化，并采用冷凍干燥處理，以得到純度較好、色價(jià)較高的葵花籽殼紅色素，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其功能性產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑色葵花籽購(gòu)于長(zhǎng)春本地，去仁留殼備用。

石油醚 天津化學(xué)試劑有限公司；鹽酸 北京化工廠；乙酸乙酯 哈爾濱市新達(dá)化工廠；無(wú)水乙醇 淄博市臨淄云天化工廠，以上試劑均為分析純；氯仿(化學(xué)純)、氯化鈉(無(wú)水，分析純) 開(kāi)原市化學(xué)試劑一廠；甲醇、乙腈(色譜純) 美國(guó)Agilent公司；薄層層析硅膠(化學(xué)純) 青島市市北區(qū)?；稍飫S；矢車菊-3-葡糖苷標(biāo)品 天津一方科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

721型分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；ARATVA-360型紅外光譜儀 美國(guó)Perkin Elmer公司；Agilent 1100 LC/ MSD TRAP 離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；LGJ-30冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色素的提取

取1000g葵花籽殼，先用石油醚脫脂兩次，之后用6倍體積的50%乙醇溶液在60℃下水浴浸提取1h，提取3次，合并濾液，過(guò)濾濃縮后，濃縮液經(jīng)1/3倍體積的無(wú)水乙醇萃取，得萃取液500mL[4]。

1.3.2 色素的純化

1.3.2.1 靜態(tài)實(shí)驗(yàn)

大孔樹(shù)脂對(duì)不同的物質(zhì)具有不同的吸附性能，通過(guò)測(cè)定靜態(tài)時(shí)樹(shù)脂對(duì)葵花籽殼紅色素的吸附率，來(lái)考察樹(shù)脂對(duì)色素的吸附容量，從而選擇合適的樹(shù)脂分離色素[5]。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前天然產(chǎn)物化學(xué)成分分離中最常用的樹(shù)脂有D-101、DA-201、AB-8、H-103、LD-605、CDA-40、D-1300、NKA-9等。本實(shí)驗(yàn)選取這8種不同的大孔吸附樹(shù)脂，經(jīng)預(yù)處理后，每份0.2g，分別置于20mL葵花籽殼紅色素原液(1.3.1節(jié)所得無(wú)水乙醇萃取液)中，室溫放置12h分別測(cè)定吸附前后樣品在波長(zhǎng)520nm處的吸光度，計(jì)算靜態(tài)吸附率和解吸率[6]。

式中：A0為初始色素液吸光度；A1為清液吸光度；A2為洗脫液吸光度。

1.3.2.2 動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)

取靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)選出的AB-8樹(shù)脂，預(yù)處理濕法裝入4cm×50cm吸附柱中，樹(shù)脂高16cm，即約50mL樹(shù)脂。取原液直接上樣。對(duì)色素進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

1.3.3 色價(jià)的變化

色價(jià)是指單位質(zhì)量原料提取物的吸光度，在不同程度上可以反映物質(zhì)的純度變化，越大表示物質(zhì)越純[7]。

不同純化程度色價(jià)的比較：采用分光光度法，比色皿lcm，測(cè)定樣品質(zhì)量濃度為1g/100mL，波長(zhǎng)520nm處的吸光度A520nm即為葵花籽殼紅色素的色價(jià)，用表示。取色素粗提和樹(shù)脂提純后色素固體各1.0g，溶于100mL蒸餾水中，測(cè)其E1c%m，比較色素液吸附前后色價(jià)的變化。

1.3.4 色素的成分分析

經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂純化后的色素，再經(jīng)濃縮、冷凍干燥處理后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.4.1 顏色反應(yīng)

移取多份等量色素，將其溶于10倍體積的蒸餾水中，通過(guò)在可見(jiàn)光下、紫外光下、硫酸介質(zhì)中、Mg2+鹽酸介質(zhì)中、FeCl3溶液中、AlCl3溶液中等條件下處理色素，觀察葵花籽殼色素的變化[8]。

1.3.4.2 Francis法測(cè)定A440nm/Amax

通過(guò)測(cè)定色素Amax/A440nm值來(lái)判斷其為單一糖苷還是雙糖苷[9]。

1.3.4.3 糖組成的測(cè)定

用1mol/L鹽酸在100℃條件下水解葵籽殼紅色素的組分1h，鹽酸與色素體積比為2:1。取出后用冰水速冷，取褐色溶液，再用正戊醇萃取至水層無(wú)色，將水層濃縮后進(jìn)行薄層層析，晾干后用顯色劑顯色，對(duì)照為葡萄糖，觀察是否有棕色斑點(diǎn)生成，且計(jì)算比移值[10-11]。

展開(kāi)劑：正丙醇、水體積比為8:2。

顯色劑為聯(lián)苯胺試劑：將體積分?jǐn)?shù)為0.5%的聯(lián)苯胺溶于20mL冰乙酸中，加入無(wú)水乙醇80mL，混合均勻，即得到聯(lián)苯胺試劑。顯色時(shí)，將其噴在薄層上，于100～150℃加熱15min，使還原糖生成棕色色斑。

1.3.5 葵花籽殼紅色素的主要成分結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.5.1 紅外光譜的檢測(cè)

采用溴化鉀壓片法：將溴化鉀結(jié)晶塊在瑪瑙研缽中研成細(xì)粉，稱取200mg溴化鉀粉末2份，一份加入色素樣品2mg研細(xì)混勻，另一份作為空白用以扣除本底，分別進(jìn)行壓片，在500～4000cm-1范圍內(nèi)測(cè)其紅外吸收光譜[12]。

1.3.5.2 高效液相色譜

色譜柱：Hypersil ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：A，水(0.5%三氟乙酸)；B，乙腈(0.5%三氟乙酸)；梯度：0～10min，10%～18%B加入A中(線性)；10～18min，18%～28% B加入A中(線性)；18～19min，28%～40% B加入A中(線性)；19～22min，40%～60% B加入A中(線性)；22～23min，60%～10% B加入A中(線性)；23～28min，10% B加入A中(等梯度)；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：520nm和280nm[13]。

1.3.5.3 質(zhì)譜

正離子掃描(ESI+，m/z100～1000)，干燥氣流為10 L/min，噴霧器壓力為50Pa，干燥氣溫為325℃。

樣品經(jīng)甲醇溶解、濾膜過(guò)濾后，上柱檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的選擇

8種大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，AB-8樹(shù)脂的效果最好，所以選取其進(jìn)行動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同樹(shù)脂對(duì)色素的吸附結(jié)果Table 1 Absorption ratios of 8 kinds of macroporous resins towards the pigment

2.2 動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選取乙醇為洗脫劑。上樣量為50mL，質(zhì)量濃度為1mg/mL，上樣流速為3mL/min，洗脫速度為1.5mL/min。

2.2.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)解吸效果的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the desorption of the pigment

分別用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液200mL進(jìn)行洗脫，由圖1可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)對(duì)色素的解吸效果最佳。因此，采用70%的乙醇溶液為色素解吸液。

2.2.2 色素溶液pH值對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響

表2 不同pH值對(duì)吸附率的影響Table 2 Effect of environmental pH on the adsorption of the pigment

表2中列出了pH值在2.0～4.0范圍內(nèi)，AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)葵籽殼色素的吸附率。色素溶液在pH2.5時(shí)，AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)其的吸附率最高，因此在色素吸附時(shí)采用pH2.5的提取液為最佳。

2.2.3 色素的解吸曲線

圖2 不同乙醇用量對(duì)解吸效果的影響Fig.2 Effect of ethanol amount on the desorption of the pigment

將上述吸附飽和的樹(shù)脂用70%乙醇溶液進(jìn)行解吸，繪制色素的解吸曲線如圖2所示。由該曲線可看出，色素解吸速度較快，僅用少量的解吸液即可使色素從樹(shù)脂上解吸下來(lái)。其用量約為5倍上樣量，且此時(shí)的解吸率達(dá)到79.46%。

2.2.4 色價(jià)比較結(jié)果

表3 色價(jià)比較結(jié)果Table 3 Comparison of color values of the pigment before and after AB-8 type resin purification

由表3可知，樹(shù)脂提純后產(chǎn)品純度較高，色素色價(jià)提高5倍以上，色價(jià)遠(yuǎn)高于粗制品，且極易成粉。

2.3 色素的成分分析

2.3.1 顏色反應(yīng)

將葵花籽殼紅色素經(jīng)物理或化學(xué)處理，觀察其顏色變化，結(jié)果如表4所示。

表4 色素的顏色反應(yīng)Table 4 Color reaction of the pigment

表4與植物色素標(biāo)準(zhǔn)顏色反應(yīng)比較，可以得出定性的結(jié)果，葵花籽殼紅色素屬于黃酮類花色苷化合物。

2.3.2 Francis法測(cè)A440nm/Amax

根據(jù)Francis的結(jié)論。即單一花色苷(3號(hào)位置)在0.1%HCl-甲醇溶液中，其A440nm/Amax百分比值一般大于20；而雙取代的花色苷(3、5號(hào)位置)在0.1%HCl-甲醇溶液中A440nm/Amax百分比值一般為10～20。通過(guò)這一比值可以推斷在3號(hào)位和5號(hào)位是否帶有糖苷鍵。對(duì)色素測(cè)其可見(jiàn)光區(qū)最大吸收波長(zhǎng)的吸光度和波長(zhǎng)440nm處的吸光度，再求兩個(gè)吸光度的比值(%)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 色素的A440nm/AmaxTable 5 A440nm/Amax of the pigment

由表5可以推測(cè)，色素為單一花色苷，即3位糖苷的花色苷衍生物。

2.3.3 薄層色譜(TLC)檢識(shí)

圖3 色素完全水解薄層色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of the final hydrolysis product of the pigment

由圖3可得出色素完全水解后糖組成的Rf值，其計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 色素組分完全水解后薄層層析的Rf×100值Table 6 One hundred-fold enlarged Rf values of the final hydrolysis product of the pigment in TLC

由表6可見(jiàn)，色素完全水解后，生成葡萄糖。為考察葡萄糖是以單糖還是雙糖方式在糖苷配基上，有必要對(duì)色素進(jìn)行部分水解。色素在水解5min時(shí)，無(wú)斑點(diǎn)顯示，水解10min乃至最后，一直顯示一個(gè)斑點(diǎn)，該斑點(diǎn)的Rf值與葡萄糖的Rf值基本一致(其差值0.01可能是人工操作帶來(lái)的誤差，且在可接受范圍內(nèi))。因此，推測(cè)色素的糖配基是由葡萄糖這個(gè)單糖組成的。

表7 不同水解時(shí)間薄層層析的Rf值Table 7 One hundred-fold enlarged Rf values of the hydrolysis products of the pigment at various hydrolysis time points in TLC

2.4 葵花籽殼紅色素主要成分的結(jié)構(gòu)鑒定

2.4.1 紅外光譜檢測(cè)結(jié)果

圖4 葵花籽殼紅色素的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of the pigment

由圖4可見(jiàn)，3391cm-1可能是羥基伸縮振動(dòng)吸收峰，1276cm-1可能是羥基C－O伸縮振動(dòng)吸收峰；1729cm-1可能是C＝O 鍵伸縮振動(dòng)吸收峰；1607、1482cm-1可能是苯環(huán)吸收峰，綜上所述，樣品主要吸收為苯環(huán)、羥基的特征吸收峰。

2.4.2 高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果

圖5 花色苷標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of anthocyanin standard

圖6 葵花籽殼紅色素樣品高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of the pigment

由圖5、6可知，樣品與花色苷標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)條件一致?tīng)顟B(tài)下出峰時(shí)間相同，都為6min，說(shuō)明樣品中存在花色苷。但樣品中還含有其他物質(zhì)，僅以現(xiàn)有條件難以分離，且性質(zhì)與矢車菊-3-葡萄糖苷性質(zhì)相似，可能也為花色苷類物質(zhì)，有待于進(jìn)一步的研究。

2.4.3 質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果

圖7 花色苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖Fig.7 MS spectrum of anthocyanin standard

圖8 葵花籽殼紅色素樣品質(zhì)譜圖Fig.8 MS spectrum of the pigment

由圖7、8可知，正離子掃描的m/z 449[M+H]+峰，碎片離子m/z 287峰，是由m/z 449失去一個(gè)質(zhì)量數(shù)162 (六碳糖基)中性碎片所得，樣品的質(zhì)譜圖中明顯顯示了此特征峰值，與標(biāo)準(zhǔn)品相一致，且與報(bào)道相一致[14]，進(jìn)一步說(shuō)明了黑葵花籽殼紅色素主要成分為矢車菊-3-葡萄糖苷。

通過(guò)高效液相色譜圖和質(zhì)譜圖表明：與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照及查閱有關(guān)文獻(xiàn)可知葵花籽殼紅色素其主要成分為矢車菊-3-葡萄糖苷。黑葵花籽殼紅色素并不是由矢車菊-3-葡萄糖苷這種單一成分所組成的，但其性質(zhì)與其相似，有待于進(jìn)一步的分離及研究。

3 結(jié) 論

對(duì)葵花籽殼紅色素的純化方法進(jìn)行了研究。采用大孔吸附樹(shù)脂吸附黑葵花籽殼紅色素，在對(duì)比的8種樹(shù)脂中，AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)色素吸附力極強(qiáng)，故選擇其為動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)樹(shù)脂。其吸附條件中：原料液pH值為2.5，吸附流速3mL/min；其洗脫條件中：洗脫劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果有較大影響，最佳洗脫體積分?jǐn)?shù)為70%，洗脫流速為1.5mL/min，洗脫量為250mL。

對(duì)葵花籽殼紅色素定性分析，通過(guò)色素在不同pH值下的光譜特征、顏色變化和色素在經(jīng)過(guò)不同方法處理后的顏色及薄層層析結(jié)果，以及紅外光譜、高效液相色譜圖及質(zhì)譜圖得出葵花籽殼紅色素應(yīng)為黃酮類花色苷化合物，且主要成分為矢車菊-3-葡萄糖苷。而且色素中還含有其他花色苷類成分，有待進(jìn)一步的鑒定。

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Purification and Structural Identification of the Major Component of the Red Pigment from Black Sunflower Seed Shell

ZHANG Hai-yue，XU He，WANG Lei
(College of Chemical and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China)

Eight kinds of macroporous adsorption resins were used for the static adsorption of the red pigment extract from black sunflower seed shell, and AB-8 type resin presented the highest adsorption ratio and was consequently selected for further investigations. The optimum conditions for the dynamic adsorption and desorption of the pigment extract were explored. After purification using AB-8 type resin under the optimized adsorption and desorption conditions, a 5-fold elevation in the color value of the pigment extract was obtained. Lyophilization gave a crystallized red pigment. The major components of the red pigment was identified to be ascyanidin-3-glucoside through qualitative tests and IR spectroscopic, thin layer chromatographic, HPLC and MS analyses.

black sunflower seed shell；red pigment；purification；structure

TS202.3

A

1002-6630(2010)17-0036-05

2010-01-20

吉林省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(吉教科合字[2006]第61號(hào))

張海悅(1967—)，女，副教授，碩士，主要從事功能食品及農(nóng)副產(chǎn)品的深加工研究。E-mail：zhhaiyue@163.com