蘇 薇，楊 潔*，沈曉麗，蔣新月

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

驢乳中蛋白質(zhì)組分的分離純化與鑒定

蘇 薇1，楊 潔2,*，沈曉麗3，蔣新月3

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

目的：分離純化并鑒定驢乳乳清中蛋白質(zhì)組分，為進(jìn)一步研究驢乳用于輔助治療疾病，以及為作為人乳替代品提供參考。方法：采用DEAE-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠層析分離純化驢乳乳清中蛋白質(zhì)組分，并通過十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳法和高效凝膠滲透色譜法對所純化蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。結(jié)果：與牛乳乳清中蛋白組分相對比，發(fā)現(xiàn)驢乳乳清中存在3種未知蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量分別為32、70.1、72.2kD。結(jié)論：驢乳中除了含有與牛乳相似的營養(yǎng)成分外，還具有其他生物活性成分，它們可能是一些保護(hù)性蛋白，在機(jī)體的抗病機(jī)制方面起著重要作用。

驢乳；蛋白質(zhì)組分；分離；純化

近年來，驢乳因其獨(dú)特的營養(yǎng)價(jià)值，已成為一種值得開發(fā)的寶貴資源，并作為一種新興的乳品引起了世界奶業(yè)研究人員的關(guān)注。有研究表明，驢乳具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，可作為牛乳蛋白過敏患者及嬰幼兒的營養(yǎng)品，并可以輔助治療動脈硬化，促進(jìn)心血管疾病患者的康復(fù)[1-2]。驢乳中溶菌酶和乳糖的含量較高，有益于益生乳酸桿菌的生長，高含量的乳糖能促進(jìn)腸對鈣的吸收，有利于在嬰幼兒時(shí)期骨骼的生長[3]。驢乳中脂質(zhì)組成與人乳相似，其中亞油酸和亞麻酸含量較高[4-5]。同時(shí)，驢乳中礦物質(zhì)含量和蛋白質(zhì)總量也接近人乳和馬乳[6-7]。因而，驢乳的開發(fā)利用有著巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)采用DEAE-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠層析分離純化驢乳乳清中蛋白質(zhì)組分，并通過十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)和高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)對所純化蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。以期為新疆驢乳用于輔助治療疾病，以及作為人乳替代品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

驢乳采自新疆烏魯木齊市郊區(qū)，-2 0℃儲藏；DEAE-52纖維素 Whatman公司；Sephadex G-100 Pharmacia公司；Fermentas非預(yù)染Marker 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BioLogic Lp層析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；真空冷凍干燥機(jī) 德國賀利氏公司；Heal Force NW系列超純水系統(tǒng) 上海力新儀器有限公司；Mini ProteinII 垂直電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Alphalmager2200凝膠處理及分析系統(tǒng) AlphaInnotech公司。

1.3 方法

1.3.1 驢乳蛋白的粗分[8]

驢乳4℃解凍，10000r/min離心15min脫脂。

脫脂乳與2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液等體積混合，用10%乙酸調(diào)pH 4.6，40℃水浴20min，8000r/min離心15min，收集上清液(乳清)，凍干、備用。沉淀(酪蛋白)用蒸餾水沖洗3次，凍干，備用。

1.3.2 離子交換層析分離驢乳乳清蛋白[9]

稱取凍干乳清粉約0.3g溶于5mL蒸餾水中，5000r/min離心10min，取上清液0.45μm微孔濾膜過濾，濾液加入DEAE-52層析柱(1.5cm×20cm)，用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8) 洗脫未被吸附的蛋白質(zhì)，用含0.1～0.4 mol/LNaCl的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)連續(xù)洗脫被吸附的蛋白質(zhì)，洗脫速度為0.5mL/min。收集洗脫峰，透析、凍干、備用。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳

將DEAE-52離子交換層析收集所得蛋白質(zhì)洗脫峰的凍干粉，進(jìn)行非連續(xù)SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠5%，分離膠為12%，恒流電流為15mA，電泳時(shí)間為1～2h。當(dāng)染料距底邊1cm時(shí)，停止電泳。經(jīng)染色、脫色，將凝膠放入Alphalmager2200凝膠處理及分析系統(tǒng)中照相。

1.3.4 凝膠層析分離純化蛋白

Sephadex G-100層析柱(1.6cm×55cm)用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)平衡，洗脫速度為0.5mL/min，取DEAE-52柱層析的各洗脫峰收集所得蛋白凍干粉10mg分別溶于3mL磷酸鹽緩沖液，5000r/min離心10min，0.45μm微孔濾膜過濾，上樣，收集洗脫峰，透析，凍干，備用。

1.3.5 高效凝膠滲透色譜(HPGPC)[10]

采用TOSOH TSK-G4000PWXL (300mm×7.8mm)色譜柱對Sephadex G-100凝膠層析所得蛋白質(zhì)洗脫峰的凍干粉進(jìn)行檢測，流速為0.5mL/min，流動相為0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.9)，檢測波長為280nm，進(jìn)樣量為20μL。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白的制備：標(biāo)準(zhǔn)蛋白(牛免疫球蛋白G：170 kD；甘氨酸氧化酶：150 kD；牛血清白蛋白：66.2 kD；卵清蛋白：45.0kD；胰蛋白酶：24kD；溶菌酶：14.4kD)分別溶于0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.9)，質(zhì)量濃度為1mg/mL，離心，0.22μm微孔濾膜過濾，加入TOSOH TSK-G4000PWXL (300mm×7.8mm)色譜柱進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 驢乳乳清蛋白的離子交換層析圖譜分析

圖1 乳清蛋白的DEAE-52離子交換層析圖Fig.1 DEAE-52 chromatographic fractionation of donkey s milk whey proteins

由圖1可知，DEAE-52離子交換層析對驢乳乳清蛋白進(jìn)行分離純化，出現(xiàn)11個(gè)蛋白質(zhì)峰。用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)洗脫，得到5個(gè)洗脫峰，即峰A、B、C、D、E；用含0.1～0.4mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)連續(xù)洗脫，得到6個(gè)洗脫峰，即峰F、G、H、I、J、K。

2.2 離子交換層析的SDS-PAGE電泳圖譜分析

圖2 DEAE-52離子交換層析各蛋白質(zhì)峰的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of protein fractions of donkey s milk whey obtained after DEAE-52 chromatographic fractionation

通過SDS-PAGE凝膠電泳檢測DEAE-52離子交換層析所得蛋白組分(圖2)，結(jié)果表明，只有峰G出現(xiàn)了一條單一蛋白條帶。而其余各峰均出現(xiàn)多條蛋白條帶，故需對所得蛋白質(zhì)組分進(jìn)一步分離純化。

2.3 凝膠層析分離純化蛋白圖譜分析

由于從DEAE-52離子交換層析收集所得蛋白組分得率較低，故只對部分蛋白組分進(jìn)行Sephadex G-100凝膠層析。圖3～8為驢乳乳清蛋白經(jīng)DEAE-52離子交換層析所得部分洗脫峰的Sephadex G-100凝膠層析圖。峰A、H、I、K的洗脫曲線為單一峰(圖3、6、7、8)，命名為A1、H1、I1、K1。峰F存在2個(gè)洗脫峰(圖4)，說明其中存在2個(gè)不同分子量的蛋白組分F1、F2。峰G存在1個(gè)洗脫峰(圖5)，說明峰G為單一蛋白組分。峰J存在3個(gè)洗脫峰(圖7)，說明其中存在3個(gè)不同分子量的蛋白組分，分別命名為J1、J2、J3。

圖3 峰A的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.3 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak A

圖4 峰F的 Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.4 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak F

圖5 峰G的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.5 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak G

圖6 峰H的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.6 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak H

圖7 峰J和I的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.7 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peaks J and I

圖8 峰K的Sephadex G-100凝膠層析圖Fig.8 Sephadex G-100 gel-filtration chromatographic purification of protein peak K

2.4 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的確定

根據(jù)5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)值與TOSOH TSK-G4000PWXL(300mm×7.8mm)色譜柱中保留時(shí)間之間的線性相關(guān)關(guān)系，用Excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.0678x+2.9999，R2=0.9802。

SephadexG-100凝膠層析分離出部分蛋白組分的HPGPC圖譜(圖9～11)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算出洗脫峰中蛋白組分的分子質(zhì)量，最終確定蛋白組分分子質(zhì)量大小及相對應(yīng)牛乳乳清中蛋白質(zhì)名稱見表1。

圖9 峰A1、F1和G1的HPGPC圖譜Fig.9 HPGPC profiles of protein peaks A1, F1and G1

圖10 峰H1、I1和K1的HPGPC圖譜Fig.10 HPGPC profiles of protein peaks H1, I1and K1

圖11 峰J1、J2和J3的HPGPC圖譜Fig.11 HPGPC profiles of protein peaks J1, J2and J3

表1 驢乳乳清中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量及相對應(yīng)牛乳乳清中蛋白質(zhì)Table 1 Identification of separated protein fractions of donkey s milk whey based on molecular mass alignment with cow s milk whey

由表1可以看出，峰A1中蛋白組分的分子質(zhì)量接近于溶菌酶，峰F1和峰J2中蛋白組分的分子質(zhì)量接近于牛血清白蛋白，峰H1和峰J3中蛋白組分的分子質(zhì)量接近于β-乳球蛋白，峰K1中蛋白組分的分子質(zhì)量接近于α-乳白蛋白。與牛乳乳清中蛋白組分相對比，發(fā)現(xiàn)驢乳乳清中存在3種未知蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量分別為32、70.1、72.2kD。

3 結(jié) 論

驢乳作為一個(gè)新的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外研究主要集中在理化指標(biāo)和營養(yǎng)特性等方面。Piccione等[11]發(fā)現(xiàn)驢乳中營養(yǎng)成分的日變化存在一定規(guī)律，脂肪和乳糖含量在夜晚達(dá)到高峰，而蛋白質(zhì)含量在白天達(dá)到高峰。Vincenzetti等[12]對驢乳中蛋白質(zhì)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)驢

乳與其他乳類相比有低酪蛋白含量和高溶菌酶含量的營養(yǎng)特性。張巖春等[13]通過對驢乳與牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)驢乳中α-乳白蛋白含量較高。張曉瑩等[14]對50頭新疆疆岳驢乳的化學(xué)成分以及微生物指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與牛乳相比驢乳各項(xiàng)指標(biāo)更接近人乳。Criscione等[15]研究發(fā)現(xiàn)西西里島的驢乳中缺乏αs1-酪蛋白。Mao等[16]研究發(fā)現(xiàn)驢乳乳清蛋白中一些活性蛋白質(zhì)組分對人肺癌細(xì)胞A549具有抗增生和抗腫瘤的作用，其分子質(zhì)量大于10 kD，這些活性蛋白質(zhì)組分能促進(jìn)細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2、干擾素-γ、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-β。驢乳中活性蛋白質(zhì)組分不僅能直接抑制腫瘤增生，還可通過激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞間接殺死腫瘤細(xì)胞。

本研究針對新疆驢乳經(jīng)脫脂，等電點(diǎn)沉淀，分離得到乳清蛋白，采用DEAE-52纖維素層析和SephadexG-100凝膠層析分離出蛋白組分，并利用SDS-PAGE凝膠電泳和高效凝膠過濾色譜對所純化蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。通過與牛乳乳清中蛋白質(zhì)相對比，發(fā)現(xiàn)新疆驢乳中存在3種未知蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量分別為32 、70.1kD和72.2 kD。這說明驢乳中除了含有與牛乳相似的營養(yǎng)成分外，還具有其他生物活性成分，它們可能是一些保護(hù)性蛋白，在機(jī)體的抗病機(jī)制方面起著重要作用。對于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為深入系統(tǒng)地研究驢乳中的生物活性成分，并確定其藥用機(jī)理，以及開發(fā)驢乳產(chǎn)品，提高驢乳的利用價(jià)值等提供科學(xué)依據(jù)。也為闡明驢乳保護(hù)性蛋白含量及其生物學(xué)活性的獨(dú)特性，為驢乳保護(hù)性蛋白的新資源奠定基礎(chǔ)。

[1]陸東林, 李雪紅, 葉爾太·沙比爾哈孜, 等. 疆岳驢乳成分測定[J].中國乳品工業(yè), 2006, 34(11): 26-28.

[2]CONTE F, PASSANTINO A. Isolation of Enterobacter sakazakii from ass milk in Sicily: Case report, safety and legal issues[J]. Travel Medicine and Infectious Disease, 2008, 6: 250-252.

[3]ZHANG Xiaoying, ZHAO Liang , JIANG Lu , et al. The antimicrobial activity of donkey milk and its microflora changes during storage[J]. Food Control, 2008, 19: 1191-1195.

[4]GUO Huiyuan, PANG Kun, ZHANG, Xiaohui, et al. Composition, physiochemical properties, nitrogen fraction distribution, and amino acid profile of donkey milk[J]. Journal of Dairy Science, 2007, 90(1): 1635-1643.

[5]BLASI F, MONTESANO D, de ANGELIS M, et al. Results of stereospecific analysis of triacylglycerol fraction from donkey, cow, ewe, goat and buffalo milk[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2008, 21: 1-7.

[6]VINCENZETTI1 S, POLIDORI1 P, SALIMEI E, et al. Purification and identification of αs1- and β-caseins from asses milk[J].Veterinary Research Communications, 2005, 29(2): 211-213.

[7]張巖春, 尤娟, 羅永康. 驢乳的主要成分及與其他乳的分析比較[J].中國食物與營養(yǎng), 2008(10): 54-55.

[8]CHIANESE L, CALABRESE M G, FERRANTI P, et al. Proteomic characterization of donkey milk caseome [J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(29): 483-484.

[9]汪家政, 范明. 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001: 189-229.

[10]TORRE G L, SAITTA M, POTORT A G, et al. High performance liquid chromatography coupled with atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry for sensitive determination of bioactive amines in donkey milk[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217: 5215-5224.

[11]PICCIONE G, FAZIO F, CAOLA G, et al.Daily rhythmicity in nutrient content of asinine milk[J]. Livestock Science, 2008, 116: 323-327.

[12]VINCENZETTI S, POLIDORI P, MARIANI P. Donkey s milk protein fractions characterization[J]. Food Chemistry, 2008, 106(2): 640-649.

[13]張巖春, 鄭酷, 尤娟, 等. 驢乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的測定[J]. 農(nóng)產(chǎn)食品科技, 2008, 2(4): 13-l4.

[14]張曉瑩, 趙亮, 鄭倩, 等. 新疆疆岳驢乳理化和微生物指標(biāo)分析[J].食品科學(xué), 2008, 29(1): 303-305.

[15]CRISCIONE A, CUNSOLO V, BORDONARO S, et al. Donkeys milk protein fraction investigated by electrophoretic methods and mass spectrometric analysis[J]. International Dairy Journal, 2009, 19: 190-197.

[16]MAO Xueying, GU Junnan, SUN Yan, et al. Anti-proliferative and antitumour effect of active components in donkey milk on A549 human lung cancer cells[J]. International Dairy Journal, 2009, 19: 703-708.

Purification and Identification of Donkey ,s Milk Protein Fractions

SU Wei1，YANG Jie2,*，SHEN Xiao-li3，JIANG Xin-yue3
(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046,China)

Objective: To provide a theoretical basis for further exploring the exploitability of donkey milk as an adjuvant for disease treatment or as a substitute for human milk. Methods: The protein fractions of donkey whey were separated and purified by DEAE-52 anion-exchange chromatography and Sephadex G-100 gel-filtration chromatography. The purified protein fractions were identified by SDS-PAGE and high-performance gel permeation chromatography. Results: Three unknown proteins having molecular masses of 32, 70.1 kD and 72.2 kD were found to be present in donkey whey in comparison with the protein composition profile of cow s milk whey. Conclusion: Along with the similar nutritional components to those in cow s milk, other bioactive components were also contained in donkey s milk, which might be some protective proteins playing an important role in protecting the organism against diseases.

donkey s milk；protein fraction；separation；purification

TS252

A

1002-6630(2010)23-0044-05

2010-09-28

蘇薇(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯こ?。E-mail：suwei658@sina.com

*通信作者：楊潔(1963—)，女，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)。E-mail：xindayangjie@sina.com