紀淑娟，張慶歡，沈昳瀟

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110161)

堿性橙Ⅱ染料快速檢測顯色劑篩選及顯色條件的優(yōu)化

紀淑娟，張慶歡，沈昳瀟

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110161)

利用堿性橙Ⅱ的顯色特性，考察堿性橙Ⅱ染料的快速檢測的最佳顯色條件。通過對不同顯色劑顯色效果與吸光度變化的觀察分析，篩選確定鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色體系為最佳顯色劑。在此基礎上對顯色反應的條件進行優(yōu)化。結果表明，鐵氰化鉀和三氯化鐵的適宜體積配比為鐵氰化鉀(3g/L):三氯化鐵(4.5g/L)=1:1，在755nm波長處測定吸光度優(yōu)化最佳條件，適宜反應條件為反應時間20min；反應溫度50℃；顯色劑用量0.7mL。

堿性橙Ⅱ；比色法；快速檢測

堿性橙Ⅱ(chrysoidine，basic orange Ⅱ)是一種偶氮類堿性染料，俗名“王金黃”，化學名為2,4-二胺基偶氮苯，分子式為C12H12N4·HCl，染料索引號為C.I. Basic Orange2(11270)，主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色[1]。根據(jù)美國衛(wèi)生研究所(NIH)化學品健康與安全數(shù)據(jù)庫資料，攝取、吸入以及皮膚接觸該物質(zhì)均會造成急性和慢性的中毒傷害。由于堿性橙比其他水溶性染料如檸檬黃、日落黃等更易于在豆制品以及鮮海魚上染色且不易褪色，因此一些不法商販用堿性橙Ⅱ?qū)Χ垢ぁⅫS魚等進行染色，以次充好，以假冒真，欺騙消費者，嚴重危害了消費者的身體健康。

《中華人民共和國食品添加劑使用衛(wèi)生標準》及《中華人民共和國食品安全法》把堿性橙列為禁止添加到食品中的物質(zhì)。2008年12月15日，衛(wèi)生部發(fā)布了首批非法食品添加劑名單，其中包括17種非食用物質(zhì)和10種易濫用的食品添加劑，堿性橙被列為非食用物質(zhì)。目前，國內(nèi)測定食品中堿性橙Ⅱ的標準方法為GB/T 23496—2009《食品中禁用物質(zhì)的檢測：堿性橙染料：高效液相色譜法》[2]。此方法的準確度和精密度高，但是需要大型儀器設備，昂貴的色譜純試劑，成本比較高，適合于實驗室精確定量測定，無法滿足農(nóng)貿(mào)市場現(xiàn)場快速檢測。本實驗利用堿性橙Ⅱ的顯色特性，篩選確定目視比較和比色測定適宜的顯色劑，并在此基礎上對顯色反應的條件進行優(yōu)化，為建立適于現(xiàn)場快速檢測食品中堿性橙Ⅱ染料的方法提供參考依據(jù)[3-11]。

1 材料與方法

1.1 試劑

堿性橙Ⅱ標準品 北京百靈威科技有限公司；無水乙醇(分析純) 天津市富宇精細化工有限公司；甲醇、丙酮、三氯化鐵、鐵氰化鉀、冰醋酸(均為分析純) 沈陽沈一精細化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

TU 1810 紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；101-2A型數(shù)顯電熱鼓風干燥箱 上海滬南科學儀器聯(lián)營廠。1.3方法

1.3.1 顯色劑的篩選

本實驗選用鹽酸、硫酸、硫代硫酸鈉和鐵氰化鉀-三氯化鐵為顯色劑，其反應原理：鹽酸和硫酸因其改變?nèi)芤旱膒H值而使堿性橙Ⅱ在溶液中的顏色發(fā)生變化；硫代硫酸鈉因為具有還原性，可以使偶氮類化合物還原成氫化偶氮化合物，繼續(xù)還原偶氮鍵生成芳胺；鐵氰化鉀-三氯化鐵體系與堿性橙Ⅱ作用生成普魯士藍[12]。

將鹽酸、硫酸、硫代硫酸鈉和鐵氰化鉀-三氯化鐵作為顯色劑，加入到堿性橙Ⅱ標準溶液中(10μg/mL)，觀察其顯色效果，分別對其進行紫外-可見光譜掃描，分析反應前后吸收光譜的變化。綜合考慮反應體系顏色變化、顯色反應靈敏度、顯色反應對條件的要求以及顯色后反應體系的穩(wěn)定性，確定適宜的顯色劑種類。

1.3.2 顯色劑與堿性橙Ⅱ顯色前后測定波長的確定

配制一定質(zhì)量濃度的堿性橙Ⅱ標準液(10μg/mL儲備液)，顯色前后，分別在200～900nm，紫外吸收光譜寬度為0.5nm，進行光譜掃描，獲得吸收光譜并確定測定波長[13]。

1.3.3 顯色反應條件的優(yōu)化[14-20]

1.3.3.1 顯色劑最佳配比的確定

通過1.3.1節(jié)確定鐵氰化鉀-三氯化鐵為最佳顯色劑，分別配制不同質(zhì)量濃度的鐵氰化鉀和三氯化鐵溶液，混合后觀察其穩(wěn)定性，并確定使用時的適宜質(zhì)量濃度和配比。

1.3.3.2 顯色反應介質(zhì)的篩選

分別考察不同pH值的甘氨酸-鹽酸緩沖液和乙酸-乙酸鈉緩沖液作顯色反應的介質(zhì)溶劑，觀察顯色體系的穩(wěn)定性。

1.3.3.3 顯色劑用量對顯色反應效果的影響

取堿性橙Ⅱ(10μg/mL儲備液) 1mL置于比色管中，加入顯色劑的量分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，配制系列測定溶液，以0號管作參比，觀察各試管間顏色差異，并分別測定吸光度，每個處理平行做3組。

1.3.3.4 顯色時間對顯色反應效果的影響

準確移取一定量堿性橙Ⅱ標準液，在一定的溫度條件下進行顯色反應，每隔10min 測定一次吸光度。

1.3.3.5 顯色溫度對顯色反應效果的影響

分別在25、30、35、40、45、50、55℃的條件下進行顯色反應，反應一定時間后，觀察顏色的差異，并分別測定吸光度，進行統(tǒng)計分析。

1.3.3.6 顯色反應正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行三因素三水平的正交試驗。正交試驗因素水平設定如表1所示。

表1 正交試驗因素水平Table1 Factors and their levels in the orthogonal array L9(34)

2 結果與分析

2.1 顯色劑的確定

表2 不同顯色劑顯色情況Table2 Color developing effects of different color developers

表3 不同顯色劑的靈敏性Table3 Sensitivity of different color developers

鹽酸、硫酸、硫代硫酸鈉和鐵氰化鉀-三氯化鐵作為顯色劑，與同質(zhì)量濃度(10μg/mL)的堿性橙Ⅱ發(fā)生顯色反應，結果見表2。

由表2可得出，堿性橙Ⅱ溶液(10μg/mL)本身顏色為黃色，加入不同顯色劑后顏色變化不同，其中，以鹽酸和硫代硫酸鈉為顯色劑，反應產(chǎn)物顏色變化不明顯，而以硫酸和鐵氰化鉀-三氯化鐵作顯色劑，反應產(chǎn)物與堿性橙Ⅱ溶液顏色差異大，尤其是以鐵氰化鉀-三氯化鐵作顯色劑，反應產(chǎn)物稀釋液與堿性橙Ⅱ溶液的顏色仍有較大差異；從反應所需條件來看，4種顯色反應均可在室溫下進行，反應產(chǎn)物均較穩(wěn)定。

表3為不同顯色劑與堿性橙Ⅱ反應的靈敏性結果。從顏色變化角度來看，不同種類顯色劑與堿性橙Ⅱ發(fā)生顯色反應的靈敏性差異較大，其中，硫酸作為顯色劑時，隨著堿性橙Ⅱ質(zhì)量濃度的降低，溶液顏色由桃紅色變?yōu)榈凵?；在堿性橙Ⅱ質(zhì)量濃度為1.0μg/mL以上時，加入硫酸后溶液顏色無明顯變化。鹽酸作為顯色劑時，溶液顏色由橙黃色變?yōu)榈S色；在堿性橙Ⅱ質(zhì)量濃度為0.5μg/mL以下時，加入鹽酸后溶液顏色無明顯變化。三氯化鐵-鐵氰化鉀作為顯色劑時，溶液顏色由綠色變?yōu)闇\綠色；在質(zhì)量濃度為0.1μg/mL時，加入顯色劑后溶液呈淺綠色，略帶黃色——顯色劑顏色。從吸光度角度看，分別稀釋5倍后測定其吸光度，結果和顏色變化情況相吻合。說明三氯化鐵-鐵氰化鉀作為顯色劑時的最低檢測濃度明顯比鹽酸和硫酸低，即此顯色劑的反應靈敏度高。

圖1為堿性橙Ⅱ稀釋液和堿性橙Ⅱ與不同顯色劑反應產(chǎn)物的吸收光譜圖。比較堿性橙Ⅱ與不同顯色劑反應前后吸收光譜圖可以看出，堿性橙Ⅱ與硫酸和鹽酸反應產(chǎn)物的最大吸光波長與其自身的最大吸光波長無明顯差別，而與鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液反應前后吸收光譜圖發(fā)生了明顯的變化。

圖1 堿性橙與不同顯色劑反應后光譜圖Fig .1 Scanning spectra of reaction products of basic orange Ⅱ with different color developers

綜合考慮反應體系顏色變化、顯色反應靈敏度、反應前后吸收光譜、顯色反應對條件的要求以及顯色后反應體系的穩(wěn)定性，最終確定鐵氰化鉀-三氯化鐵混合液為適宜的顯色劑。

2.2 顯色反應前后的最大吸光波長

如圖2所示，堿性橙Ⅱ的最大吸光波長為460nm左右，與鐵氰化鉀-三氯化鐵發(fā)生顯色反應產(chǎn)物在波長755nm處出現(xiàn)最大吸收峰，故確定以鐵氰化鉀-三氯化鐵作顯色劑測定堿性橙Ⅱ殘留量的波長為755nm。

圖2 堿性橙Ⅱ顯色前后吸收光譜Fig.2 Comparison on scanning spectra of basic orangeⅡand reaction product between it and potassium ferricyanide /Iron (Ⅲ) system

2.3 顯色反應條件的優(yōu)化

2.3.1 顯色劑適宜質(zhì)量濃度與配比的確定

目測觀察結果表明，鐵氰化鉀和三氯化鐵以體積比1:1混合后，不論各自質(zhì)量濃度大小，隨著存放時間的延長，混合液都有不同程度的沉淀物質(zhì)產(chǎn)生；由圖3可見，體積比均為1:1的顯色劑溶液中，在835nm波長下測定鐵氰化鉀和三氯化鐵混合以后的顯色劑溶液吸光度隨時間的變化。隨著時間的延長，此顯色劑在測定波長下吸光度逐漸增加，說明鐵氰化鉀和三氯化鐵混合以后的顯色劑不夠穩(wěn)定，需要使用前現(xiàn)混合。在所設定的5種配比范圍內(nèi)，以鐵氰化鉀(3g/L):三氯化鐵(4.5g/L) =1:1時，穩(wěn)定時間最長。

圖3 顯色劑混合物質(zhì)量濃度對穩(wěn)定性的影響Fig.3 Screening for optimal composition of potassium ferricyanide / Iron (Ⅲ) system

2.3.2 顯色反應介質(zhì)溶劑的確定

為了解決顯色產(chǎn)物的沉淀問題，對顯色反應介質(zhì)進行研究。以不同pH值的甘氨酸-鹽酸緩沖液和乙酸-乙酸鈉緩沖液作顯色反應的介質(zhì)，結果如表4所示。用甘氨酸-鹽酸緩沖液作介質(zhì)時顯色穩(wěn)定性較差；而在pH2.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液中顯色后溶液穩(wěn)定性較好，顯色產(chǎn)物的穩(wěn)定時間足以滿足測定要求，故選用pH2.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液作為反應的介質(zhì)溶液。

表4 不同介質(zhì)溶劑對顯色反應的影響Table4 Effects of medium solvent type and pH on color development

2.3.3 顯色劑用量對顯色效果的影響

如表5所示，當顯色劑用量達到0.8mL以上時，隨著顯色劑用量的變化，反應產(chǎn)物顏色變化不明顯。不同用量顯色劑反應產(chǎn)物吸光度統(tǒng)計分析結果(表6)表明，顯色劑用量在0.4～0.7mL時，反應產(chǎn)物吸光度差異不顯著。根據(jù)顯色劑用量選擇的原理：1)反應液中所有的堿性橙Ⅱ都應該反應完；2)反應產(chǎn)物的最大吸收波長處的最大吸光度應該小于2.0， 最好是小于1.5。綜合考慮反應的顯色效果、吸光度差異性和顯色劑用量選擇原理，確定顯色劑用量為0.5～0.7mL比較適宜。

表5 不同顯色劑用量的顯色效果比較Table5 Effects of color developer amount on color development

表6 不同顯色劑用量對顯色效果影響的多重比較Table6 Multiple comparison on effects of color developer amount on color development

2.3.4 反應時間對顯色反應效果的影響

從圖4可以看出，在一定溫度條件下，顯色劑加入后，吸光度隨反應時間的延長而增加。在反應的前20min內(nèi)，吸光度增加幅度大，20min后，吸光度趨于平穩(wěn)，故確定堿性橙Ⅱ檢測的適宜顯色反應時間為20min。

圖4 反應時間對顯色反應產(chǎn)物吸光度的影響Fig.4 Effect of reaction time on color development

2.3.5 反應溫度對顯色效果的影響

表7 顯色反應溫度對顯色效果的影響Table7 Effect of reaction temperature on color development

表8 顯色溫度對顯色效果的多重比較Table8 Multiple comparison on effect of reaction temperature on color development

由表7可以看出，反應溫度對顯色效果有明顯的影響，隨著反應溫度的升高，顯色后溶液的吸光度隨之增加，但在35～50℃肉眼觀察顏色變化不明顯。統(tǒng)計分析結果(表8)表明，反應溫度為50、55℃兩個處理顯色反應產(chǎn)物吸光度顯著高于其他處理，二者之間差異不顯著；顯色溫度為40、45℃和50℃處理之間差異顯著。故初步確定適宜反應溫度為50℃。

2.3.6 顯色反應正交試驗

通過單因素試驗，初步確定顯色反應的適宜條件，在此基礎上，進一步對顯色劑用量、顯色時間和顯色溫度進行了三因素三水平正交試驗，試驗結果如表9所示。根據(jù)正交試驗結果，對試驗結果影響的主次順序為B(顯色溫度) ＞C(顯色劑用量)＞AB＞A(顯色時間)，鐵氰化鉀-三氯化鐵測定堿性橙Ⅱ的最佳條件為顯色時間20min；顯色溫度50℃；顯色劑用量0.7mL。

表9 正交試驗設計及結果Table9 Orthogonal array design layout and experimental results

3 結 論

利用堿性橙Ⅱ與某些試劑發(fā)生顯色反應的特點可以快速檢測其在食品中殘留量。本實驗綜合分析堿性橙Ⅱ與不同種類顯色劑發(fā)生反應前后顏色的變化、顯色反應靈敏度、反應前后吸收光譜、顯色反應對條件的要求以及顯色后反應體系的穩(wěn)定性等，確定鐵氰化鉀-三氯化鐵混合液為適宜的顯色劑。該顯色劑與堿性橙Ⅱ反應可生成普魯士藍[12]，且生成物質(zhì)的量與反應物濃度成線性關系，該物質(zhì)在酸性溶液中易溶解。介質(zhì)的pH值對顯色反應的穩(wěn)定性有較大影響，實驗確定用pH2.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液作反應介質(zhì)溶液，反應20min時顯色效果最佳。溫度對顯色反應有一定影響，隨著反應溫度的升高，達到反應平衡所需時間有所縮短，實驗確定反應最佳溫度為50℃。鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑的用量對顯色的效果影響較大，實驗表明0.7mL 為最佳使用量?；旌虾箫@色劑放置時間過長會產(chǎn)生沉淀，可分別配制鐵氰化鉀和三氯化鐵溶液，臨用前現(xiàn)混合。

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Screening for Colour Developer and Optimization of Reaction Conditions for Fast Determination of Basic Orange Ⅱ in Foods

JI Shu-juan，ZHANG Qing-huan，SHEN Yi-xiao
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)

Using the ability of basic orange Ⅱ to develop color, a fast method was presented for the determination of this dye. The optimal conditions for color development were investigated. A reagent system composed of potassium ferricyanide and Iron (Ⅲ) was found to the best color developer through comparative analysis of color developing effects of different color developers and observation of absorbance change, and the optimal ratio of potassium ferricyanide solution (3 g/L) to ferric chloride solution (4.5 g/L) was 1:1. The optimal reaction conditions were determined based on absorbance at 755 nm wavelength as follows: color developer amount, 0.7 mL; and reaction temperature, 50 ℃ for a reaction duration of 20 min.

basic orange Ⅱ；colorimetry；ast determination

TS207.3

A

1002-6630(2010)20-0394-05

2010-06-23

遼寧省教育廳重點項目(2009A633)

紀淑娟(1960—)，女，教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量控制。E-mail：jsjsyau@sina.com