劉翼翔，劉宗林，籍保平，吳永沛*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京市食品研究所，北京 100076；3.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

巖藻聚糖中重金屬元素脫除方法的研究

劉翼翔1，劉宗林2，籍保平1，吳永沛3,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京市食品研究所，北京 100076；3.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

研究采用螯合劑及超濾技術(shù)脫除巖藻聚糖中重金屬元素的方法。在提取巖藻聚糖工藝中添加不同濃度的EDTA二鈉和植酸溶液，對(duì)所制備的巖藻聚糖采用電感耦合等離子體-質(zhì)譜技術(shù)(ICP-MS)及氫化物-原子熒光光譜法(HGAFS)檢測(cè)其Mg、Ca、Fe、Mn、Cu、Zn、Ag、Cd、Ba、Pb、As、Hg元素的含量。研究表明，在提取工藝中加入1.0×10-2mol/L EDTA二鈉可以有效地降低巖藻聚糖中Mg、Ca、Mn、Zn、As、Ag、Cd、Pb等元素的殘留量，但沒(méi)有減少Hg、Fe、Cu、Ba元素的殘留量；而提取工藝中加入0.10mol/L植酸僅對(duì)減少Ag、Cd和Zn元素的殘留量有一定的效果。通過(guò)對(duì)巖藻聚糖進(jìn)行As、Hg富集處理，研究在酸處理后采用超濾脫除重金屬元素的效果，結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組均未檢出As元素，但對(duì)Hg元素沒(méi)有效果。因此，在提取巖藻聚糖的工藝中添加一定濃度的EDTA二鈉或在純化過(guò)程中經(jīng)酸處理后采用超濾脫除技術(shù)均可顯著減少巖藻聚糖制品中重金屬元素的殘留量，從而制備高質(zhì)量的巖藻聚糖。

巖藻聚糖；重金屬；酸處理；超濾；螯合劑

巖藻聚糖也稱褐藻糖膠或巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan)，為存在于褐藻細(xì)胞壁的一種硫酸多糖[1]。經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾，巖藻聚糖具有抗病毒[2]、抗血栓[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、抗凝血[6]等生物活性，已經(jīng)成為海洋藥物的重要原料之一。巖藻聚糖分子結(jié)構(gòu)中富含磺酸基和糖醛酸，具有聚陰離子體系特征[7]，對(duì)重金屬離子有很強(qiáng)的吸附和結(jié)合能力。經(jīng)檢測(cè)，從海帶中直接提取的巖藻聚糖中的As、Hg元素含量分別為2.8、0.12mg/kg[8]。未經(jīng)脫除重金屬的巖藻聚糖在進(jìn)入人體胃里的時(shí)候，由于胃酸的pH值在1～2之間，其中的重金屬會(huì)解離出來(lái)，從而對(duì)人體造成潛在危害。

硫酸多糖與金屬離子之間的作用主要有離子交換作用、配位作用、螯合作用、靜電吸附、氫鍵作用等[9-10]。參與結(jié)合金屬離子的功能基團(tuán)主要有磺酸基、羥基、羰基等。因此，由于結(jié)構(gòu)的差異，不同多糖與金屬離子間的作用有所不同。pH值是影響硫酸多糖與金屬離子相互作用的主要因素之一。在pH值較低條件下，磺酸基結(jié)合金屬離子的能力很弱；羥基只有在pH＞10的條件下才能與金屬離子結(jié)合[11]。

據(jù)報(bào)道，螯合劑EDTA二鈉有助于殼聚糖中重金屬的解吸附，從而有助于降低殼聚糖中重金屬元素的含量[12]；Unal[13]研究金屬離子與褐藻膠相互作用的機(jī)理，認(rèn)為主要是通過(guò)絡(luò)合平衡移動(dòng)完成的，而Ca-褐藻膠對(duì)Cd2+、Cu2+、Al3+以及Pb2+等的吸附主要是通過(guò)與羧基上的Ca2+進(jìn)行離子交換作用，并發(fā)現(xiàn)pH5.0時(shí)的吸附能力是pH3.0時(shí)的2倍。

隨著巖藻聚糖藥用價(jià)值的進(jìn)一步開發(fā)，巖藻聚糖分子結(jié)構(gòu)與金屬元素的相互作用機(jī)理等問(wèn)題成為熱點(diǎn)。但目前這方面研究較少，還未見有關(guān)脫除巖藻聚糖中重金屬元素方法的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分別采用在提取巖藻聚糖過(guò)程中添加金屬螯合劑EDTA二鈉和植酸來(lái)降低巖藻聚糖中重金屬的殘留量和采用超濾技術(shù)脫除巖藻聚糖中重金屬。本研究將對(duì)制備低重金屬殘留的巖藻聚糖有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶粉(食品級(jí)，80目) 福建省莆田市日紀(jì)食品有限公司。

硝酸(GR)、鹽酸(GR)、硫脲(AR)、硼氫化鉀(AR)上海國(guó)藥集團(tuán)試劑公司；汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW(E)080126)、砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW(E)080117) 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；金屬元素混標(biāo) 安捷倫公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

質(zhì)譜儀 美國(guó)安捷倫公司；AF-640型原子熒光光譜儀 北京瑞利分析儀器公司；MDS-2003F型微波消解制樣系統(tǒng)儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；超濾系統(tǒng) Millpore Labscale公司：BS 224S型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；DDS-307型電導(dǎo)率儀 江蘇江分電分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 巖藻聚糖的提取

參考Li等[14]的方法。80目海帶粉經(jīng)80℃熱水提取，0.10mol/L HCl 沉淀褐藻膠，并分別以30%和60%乙醇(V/V)分級(jí)沉淀得到巖藻聚糖粗品，經(jīng)超濾脫鹽、凍干后得到巖藻聚糖樣品。

1.3.2 巖藻聚糖化學(xué)成分分析

灰分：灼燒法[15]；蛋白質(zhì)：微量凱氏定氮法[16]；磺酸基：BaCl2-明膠比濁法[17]；糖醛酸：咔唑試劑法[18]；總糖：蒽酮硫酸法[19]。

1.3.3 螯合劑法降低巖藻聚糖中重金屬殘留

提取方法見1.3.1節(jié)，在離心除去褐藻酸沉淀后，根據(jù)上清液的體積，分別加入一定量的EDTA二鈉和植酸，使上清液中EDTA二鈉的終濃度分別為2.0×10-3、4.0×10-3、6.0 ×10-3、8.0 ×10-3、1.0 ×10-2mol/L， 而植酸的終濃度分別為2.0×10-2、4.0×10-2、6.0×10-2、8.0×10-2、1.0×10-1mol/L?；靹蚝?，靜置，使溶液中的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行30min。后續(xù)操作同1.3.1節(jié)。

1.3.4 超濾法降低巖藻聚糖中重金屬殘留

巖藻聚糖富集As、Hg：稱取5.0g巖藻聚糖并溶于1.0L 10mg/mL As、Hg混合液中，4℃放置過(guò)夜。富集后的多糖用去離子水超濾洗去游離態(tài)As、Hg。濃縮液用60%乙醇沉淀、離心，干燥后得到富含As、Hg的巖藻聚糖。

巖藻聚糖中重金屬的脫除：分別稱取1.0g富集前后的巖藻聚糖，并溶于100mL用HCl調(diào)好pH值的去離子水中(pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)，于4℃下放置過(guò)夜。采用相對(duì)分子質(zhì)量為50000的超濾膜超濾洗脫重金屬。操作時(shí)分別用同樣pH值的去離子水洗脫，從500mL濃縮到200mL，洗脫3次。將濃縮液冷凍干燥，多糖放入干燥器中保存?zhèn)溆?。在相同條件下，采用5.0×10-3mol/L EDTA二鈉-HCl溶液進(jìn)行洗脫比較。

1.3.5 重金屬含量檢測(cè)

樣品消解參考文獻(xiàn)[8]方法。As、Hg元素采用HGAFS檢測(cè)；Mg、Ca、Fe、Mn、Cu、Zn、Ag、Cd、Ba、Pb采用ICP-MS檢測(cè)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得各金屬元素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)成分分析

從表1可以看出，巖藻聚糖中灰分含量接近30%，這與董平等[20]的檢測(cè)結(jié)果(22.88%)比較一致。而且?guī)r藻聚糖中灰分的含量接近海帶的2倍，說(shuō)明巖藻聚糖是海帶富集金屬離子的主要原因之一。巖藻聚糖中磺酸基和糖醛酸含量都接近20%，是巖藻聚糖結(jié)合金屬離子的主要功能基團(tuán)。

表1 海帶與巖藻聚糖化學(xué)成分Table 1 Chemical components of seaseed and fucoidans prepared in this study %

2.2 金屬螯合劑對(duì)降低巖藻聚糖中重金屬殘留的效果

2.2.1 EDTA二鈉對(duì)降低巖藻聚糖中重金屬殘留的效果

在提取工藝中添加一定濃度的EDTA二鈉，利用ICP-MS和HGAFS檢測(cè)巖藻聚糖中重金屬殘留，結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，巖藻聚糖中存在的金屬離子主要為Mg、Ca、Mn、Fe，少量的Zn以及微量的Hg、As、Cu、Ag、Cd、Ba及Pb。與對(duì)照相比，1.0×10-2mol/L EDTA可將巖藻聚糖中Ag和Cd的殘留量降低100倍左右，將Mg、Ca、Mn、Pb和Zn殘留量減低10倍左右，對(duì)As也有一定的效果；但對(duì)降低Hg、Fe、Cu、Ba的殘留量沒(méi)有效果。除Mg、Ca外，其他金屬離子殘留量的減少與EDTA濃度的增加均無(wú)明顯關(guān)系。

2.2.2 植酸對(duì)降低巖藻聚糖中重金屬殘留的效果

在提取工藝中添加一定濃度的植酸，利用ICP-MS和HGAFS檢測(cè)巖藻聚糖中重金屬殘留，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，在巖藻聚糖的提取工藝中添加0.10mol/L植酸，實(shí)驗(yàn)組的Ag和Cd殘留量與對(duì)照組相比，降低100倍左右，同時(shí)樣品中的Zn殘留量也被降低了10倍左右，但對(duì)降低其他金屬離子的殘留量均沒(méi)有效果。由于巖藻聚糖中含有非常豐富的糖醛酸，其本身也是一種螯合劑，這可能是導(dǎo)致巖藻聚糖中某些金屬離子沒(méi)有減少的主要原因。

硫酸多糖與重金屬離子之間的作用是一個(gè)動(dòng)態(tài)遷移平衡的過(guò)程，對(duì)pH值較為敏感。這是因?yàn)閜H值會(huì)影響大分子中某些原子或基團(tuán)的質(zhì)子化[10]。在較低pH值條件下，褐藻酸的鈣、鎂鹽等被質(zhì)子化，大量Ca2+、Mg2+等離子從褐藻酸鹽中電離出來(lái)，而褐藻酸則被沉淀下來(lái)。巖藻聚糖中的磺酸基是強(qiáng)電解質(zhì)，在較強(qiáng)的酸度下，結(jié)合于其上的某些金屬離子也會(huì)漸漸地解離出來(lái)，此時(shí)利用EDTA二鈉、植酸的弱電解質(zhì)性質(zhì)，在酸性條件下與巖藻聚糖競(jìng)爭(zhēng)吸附金屬離子。

表2 添加EDTA二鈉對(duì)巖藻聚糖中重金屬元素殘留量的影響Table 2 Effect of adding EDTA-Na2 on the contents of heavy metal elements in prepared fucoidans mg/kg

表3 添加植酸對(duì)巖藻聚糖中重金屬殘留量的影響Table 3 Effect of adding fytic acid on the contents of heavy metal elements in prepared fucoidans mg/kg

2.2.3 超濾技術(shù)脫除重金屬元素的效果

2.2.3.1 超濾技術(shù)脫除巖藻聚糖中As和Hg

As、Hg是海洋藻類污染的主要重金屬，因此，本實(shí)驗(yàn)選用此兩種重金屬元素作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討脫除方法的效果。利用HGAFS進(jìn)行分析，結(jié)果如表4所示。用pH≤3.5的酸處理巖藻聚糖，經(jīng)超濾后可以顯著減少As的殘留量，經(jīng)pH2.0的酸處理的樣品已檢測(cè)不到As；當(dāng)pH4.0時(shí)，對(duì)減少As的殘留沒(méi)有效果。在pH2.0～4.0范圍內(nèi)，超濾不能降低巖藻聚糖中Hg的殘留量。此外，在酸處理過(guò)程中加入5.0×10-3mol/L競(jìng)爭(zhēng)性螯合劑EDTA，在pH2.0～4.0范圍內(nèi)處理巖藻聚糖均未檢出As，但對(duì)脫除Hg沒(méi)有效果。這說(shuō)明，在用酸處理結(jié)合超濾技術(shù)脫除巖藻聚糖中重金屬過(guò)程中加入一定量的EDTA二鈉，可以降低處理巖藻聚糖的酸度，從而減少因酸度過(guò)大造成的對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞。

巖藻聚糖在酸性溶液中的水解情況如表5所示。以相對(duì)分子質(zhì)量為5萬(wàn)的超濾膜截留溶液中的巖藻聚糖，并對(duì)截留液進(jìn)行分析。結(jié)果表明，pH＜3.0時(shí)酸處理對(duì)巖藻聚糖有較大的水解作用。當(dāng)pH2.0時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量小于5萬(wàn)的組分接近60%。但酸處理對(duì)巖藻聚糖中磺酸基含量沒(méi)有影響。

2.2.3.2 巖藻聚糖對(duì)As、Hg富集作用的研究

圖1 富集前后巖藻聚糖中As和Hg的含量Fig.1 Contents of As and Hg in fucoidans before and after binding

由于巖藻聚糖制品的重金屬含量較低，儀器檢測(cè)有較大的誤差。為了使研究結(jié)果有更強(qiáng)的說(shuō)服力，采用富集的方法以提高巖藻聚糖中As、Hg的含量，可以更直觀反映酸法結(jié)合超濾作用對(duì)脫除巖藻聚糖重金屬的效果，減少由儀器檢測(cè)精密度等引起的實(shí)驗(yàn)誤差。

巖藻聚糖經(jīng)富集處理后的結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，富集后的巖藻聚糖中As、Hg含量從原來(lái)的2.8、0.13mg/kg分別上升到21、3.0mg/kg。

2.2.3.3 超濾脫除富集后巖藻聚糖中As和Hg的效果

表4 pH值對(duì)脫除巖藻聚糖中As和Hg的影響Table 4 Effect of pH on the removal of As and Hg from fucoidans

表5 pH值對(duì)降解巖藻聚糖的影響Table 5 Effect of pH on the degradation of fucoidans

表6 pH值對(duì)脫除富集后巖藻聚糖中As和Hg的影響Table 6 Effect of pH on the contents of As and Hg in fucoidans after ultrafiltration

從表6可看出，富集化的巖藻聚糖在pH2.0～4.0內(nèi)，經(jīng)超濾處理后檢測(cè)不到As，而Hg的含量沒(méi)有明顯變化，與未富集處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。這進(jìn)一步說(shuō)明了Hg與巖藻聚糖的結(jié)合能力強(qiáng)于As，質(zhì)子化作用并不能使Hg從巖藻聚糖上脫落下來(lái)，巖藻聚糖對(duì)Hg的結(jié)合力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于As。

3 結(jié) 論

在提取工藝中，利用酸沉淀褐藻酸時(shí)提取液呈酸性，加入1.0×10-2mol/L的EDTA二鈉可以有效減少M(fèi)g、Ca、Mn、Zn、As、Ag、Cd、Pb在巖藻聚糖中的殘留量，但沒(méi)有減少Hg、Fe、Cu、Ba的殘留量。加入植酸的效果比不上EDTA二鈉，僅對(duì)降低Ag、Cd和Zn的殘留量有較好的效果。巖藻聚糖含有糖醛酸，其本身也是一種螯合劑，所以采用金屬離子螯合劑不可能完全消除巖藻聚糖中的重金屬殘留。對(duì)制備后的巖藻聚糖進(jìn)行重金屬離子脫除的研究發(fā)現(xiàn)，富集后的巖藻聚糖在經(jīng)pH2.0～4.0的鹽酸處理并經(jīng)超濾洗脫后，各處理檢測(cè)不到As，但對(duì)減少Hg的殘留量沒(méi)有作用，說(shuō)明巖藻聚糖結(jié)合Hg的能力較結(jié)合As的強(qiáng)；對(duì)未經(jīng)富集處理的巖藻聚糖的研究發(fā)現(xiàn)，在pH≤3.5下利用超濾洗脫巖藻聚糖中的重金屬，對(duì)As有較好的效果，同樣對(duì)Hg沒(méi)有效果，且?guī)r藻聚糖水解比較嚴(yán)重；在相同處理下加入5.0×10-3mol/L EDTA二鈉可以在pH4.0下完全脫除As。因此，在利用酸處理結(jié)合超濾脫除巖藻聚糖中的重金屬元素時(shí)添加一定量的EDTA二鈉可以降低處理巖藻聚糖的酸度，從而減少對(duì)巖藻聚糖結(jié)構(gòu)的破壞。

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Methods of Removing Heavy Metals for Extracting and Purifying Fucoidans from Brown Seaseeds

LIU Yi-xiang1，LIU Zong-lin2，JI Bao-ping1，WU Yong-pei3,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. Beijing Food Research Institute, Beijing 100076, China；3. College of Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China)

In order to remove heavy metals, different concentrations of ethylene diamine tetraacetic acid disodium (EDTA-Na2)and fytic acid were separately added during the extraction of fucoidans from brown seaseeds, and the prepared products were determined by inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) and hydride generation atomic fluorescence spectroscopy (HGAFS) for the contents of metal elements (such as Mg, Ca, Fe, Mn, Cu, Zn, Ag, Cd, Ba, Pb, As and Hg). Adding 1.0 ×10-2mol/L EDTA-Na2 could efficiently reduce the contents of Mg, Ca, Mn, Zn, As, Ag, Cd and Pb in the prepared fucoidans,but had no effect on Hg, Fe, Cu and Ba. However, only Ag, Cd and Zn exhibited lower contents due to the addition of 0.10 mol/L fytic acid. The simultaneous binding of As and Hg to fucoidans was conducted in order to evaluate the efficiency of removing heave metal element by acidic treatment followed by ultrafiltration. As a result, no As was detected in the ultrafiltration retenate,while Hg was kept bound with fucoidans after acidic treatment and could not be removed. Thus, adding an appreciate concentration of EDTA-Na2 during extraction and acidic treatment followed by ultrafiltration during purification can obviously reduce the contents of heavy metal elements in the prepared fucoidans. This study provides a good strategy for preparing high-quality fucoidans.

fucoidans；heavy metal elements；acidic treatment；ultrafiltration；chelating agents

S912

A

1002-6630(2010)20-0001-05

2010-01-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(40771185)；集美大學(xué)中青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)(2006A002)

劉翼翔(1982—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：lyxjmu@163.com

*通信作者：吳永沛(1956—)，男，教授，本科，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。E-mail：wuypei@jmu.edu.cn