楊雪飛，潘利華，羅建平*

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

藍(lán)莓色素的超聲提取工藝及穩(wěn)定性

楊雪飛，潘利華，羅建平*

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計(jì)方法優(yōu)化藍(lán)莓色素的超聲提取工藝，并分析色素的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：藍(lán)莓色素超聲提取工藝的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、料液比(g/mL)1:13、超聲溫度55℃、pH4.5、超聲功率450W、超聲時(shí)間50min。在此條件下，藍(lán)莓色素提取率為274.36U/g。藍(lán)莓色素耐熱，在K+、Na+、Mg2+等金屬離子以及山梨酸鉀等食品添加劑條件下穩(wěn)定性較高，而在Zn2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+及堿性環(huán)境條件下不穩(wěn)定。

藍(lán)莓；超聲提?。惶烊簧?；穩(wěn)定性；中心組合設(shè)計(jì)

藍(lán)莓為杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium spp.)多年生落葉或常綠灌木果樹，其果實(shí)為漿果，近圓形，呈藍(lán)色，是少有的藍(lán)色食物之一。藍(lán)莓果果肉細(xì)膩，甜酸可口，不僅含有VA等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且富含天然藍(lán)色素[1-2]。研究表明，藍(lán)莓藍(lán)色素的主要成分為花青素(anthocyanins)[3]，是一種強(qiáng)有力的抗氧化劑，具有保護(hù)人體免受自由基損傷，增強(qiáng)免疫力等功效，對(duì)眼科疾病和心腦血管疾病也有較好的療效[4-6]，因此可作為一種天然色素資源應(yīng)用于食品、制藥和化妝品等行業(yè)。

提取花青素的常規(guī)方法為乙醇浸提。但乙醇浸提法存在耗時(shí)長(zhǎng)、效率低的缺陷，并且長(zhǎng)時(shí)間的浸提易導(dǎo)致花青素降解而降低其抗氧化活性[7]。超聲提取法通過(guò)超聲波空化等效應(yīng)加速物質(zhì)的溶出，具有提取周期短、效率高的優(yōu)勢(shì)，受到廣泛關(guān)注[8-9]。中心組合設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)是一種基于統(tǒng)計(jì)技術(shù)的優(yōu)化方法，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精度高、預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于化工、生物等許多領(lǐng)域[10]。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出影響藍(lán)莓色素提取率的關(guān)鍵提取工藝，再通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù)，最后分析測(cè)定超聲提取產(chǎn)物藍(lán)莓色素的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓凍果 安徽徽王食品有限公司；D101大孔樹脂 天津波鴻樹脂科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)有限公司；SY-1000E多用途恒溫超聲提取器 北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠。

1.3 藍(lán)莓色素提取工藝流程

藍(lán)莓冷凍鮮果→清洗→搗碎→超聲提取→抽濾→離心(4000r/min，15min)→清液→蒸發(fā)濃縮→過(guò)D101大孔樹脂→乙醇洗脫→洗脫液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇→冷凍干燥→藍(lán)莓色素

1.4 藍(lán)莓色素超聲提取條件的優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn)條件

稱取清洗干凈的藍(lán)莓冷凍鮮果40.0g用植物組織搗碎機(jī)搗碎，轉(zhuǎn)入超聲波提取器中，按一定比例加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取劑，在設(shè)定超聲溫度和超聲功率條件下超聲提取一定時(shí)間后，取出抽濾，取濾液離心，收集上清液，測(cè)定上清液中藍(lán)莓色素的含量。研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度、p H值、超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓色素提取率的影響。

1.4.2 中心組合試驗(yàn)條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取適當(dāng)條件范圍進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)(表1)優(yōu)化藍(lán)莓色素超聲提取工藝參數(shù)。

表1 中心組合試驗(yàn)因素水平編碼表Table1 Factors and levels in the central composite design

1.5 藍(lán)莓色素的穩(wěn)定性研究

用于穩(wěn)定性研究的藍(lán)莓色素均來(lái)自于優(yōu)化后的超聲提取條件下的提取物，經(jīng)D101大孔樹脂用乙醇洗脫后凍干獲得的產(chǎn)物。

1.5.1 pH值對(duì)藍(lán)莓色素穩(wěn)定性的影響

藍(lán)莓色素溶液的pH值對(duì)其色澤有較大影響。隨著溶液pH值的增高(堿性增強(qiáng))，色素水溶液由藍(lán)紫色(酸性環(huán)境)轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色(中性環(huán)境)后褪色為淺黃色(堿性環(huán)境)，最大吸收波長(zhǎng)亦發(fā)生變化，藍(lán)紫色、紫紅色、淺黃色藍(lán)莓色素溶液最大吸收峰分別為520、490nm和380nm。本研究考察藍(lán)紫色藍(lán)莓色素溶液的性質(zhì)，所以均以520nm處的吸光度表征。

用雙蒸水配制0.03mg/mL藍(lán)莓色素溶液，分別取50mL置于不同的錐形瓶中，用HCl溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值分別為pH3.0、5.0、7.0、9.0，放置室內(nèi)暗處25℃保存，定時(shí)取樣測(cè)定520nm處的吸光度。

1.5.2 溫度對(duì)藍(lán)莓色素穩(wěn)定性的影響

用雙蒸水配制0.03mg/mL藍(lán)莓色素溶液，分別取5 0 mL置于不同的錐形瓶中，將錐形瓶分別置于4、25、85℃的避光環(huán)境中保存，定時(shí)取樣測(cè)定520nm處的吸光度。

1.5.3 食品添加劑對(duì)藍(lán)莓色素穩(wěn)定性的影響

用雙蒸水配制0.03mg/mL藍(lán)莓色素溶液，分別取50mL置于不同的錐形瓶中，再向錐形瓶分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%葡萄糖、1%蔗糖、0.1%山梨酸鉀、0.1%苯甲酸鈉和0.1%抗壞血酸，放置室內(nèi)暗處25℃保存，定時(shí)取樣測(cè)定520nm處的吸光度。

1.5.4 金屬離子對(duì)藍(lán)莓色素穩(wěn)定性的影響

用雙蒸水配制0.03mg/mL藍(lán)莓色素溶液，分別取50mL置于不同的錐形瓶中，再向錐形瓶分別加入終濃度為0.1mol/L的KCl、MgCl2、ZnCl2、NaCl、FeCl2、FeCl3、CaCl2，放置室內(nèi)暗處25℃保存，定時(shí)取樣測(cè)定520nm處的吸光度。

1.6 藍(lán)莓色素的色價(jià)測(cè)定

[11]的方法，取經(jīng)超聲提取離心獲得的部分上清液放入1cm比色皿中，使其吸光度在0.2～0.7范圍內(nèi)，并測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)520nm下的吸光度。以色價(jià)的大小表征藍(lán)莓色素提取率的高低。

色價(jià)/(U/g)= A520nm×稀釋倍數(shù)×10/m式中：m為藍(lán)莓干質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓色素超聲提取的單因素分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓色素提取率的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of blueberry pigments

由圖1可知，在料液比1:10、超聲溫度50℃、pH自然、超聲功率400W、超聲時(shí)間60min條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)為25%～65%時(shí)，藍(lán)色色素提取率沒有顯著差別(P＞0.05)；乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%時(shí)提取率達(dá)最大值183.95U/g；乙醇體積分?jǐn)?shù)大于45%時(shí)，提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加略有下降。由于藍(lán)色色素是一類極性較大的花青素物質(zhì)，易溶于水、乙醇、稀酸等極性溶劑中[12]，在45%乙醇溶液中，醇溶性和水溶性的花青素類物質(zhì)都能最大程度的溶出，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)45%時(shí)，水溶性花青素溶出量減少，因此藍(lán)色色素得率減少。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%。

2.1.2 料液比對(duì)藍(lán)莓色素提取率的影響

圖2 料液比對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of blueberry pigments

由圖2可以看出，在超聲溫度50℃，pH自然、超聲功率400W、超聲時(shí)間60min條件下，當(dāng)液料比在5～15mL/g時(shí)，提取率隨液料比的增大而增長(zhǎng)較快，當(dāng)液料比大于15mL/g時(shí)，提取率有所下降，可能是因?yàn)閱挝惑w積提取劑中對(duì)藍(lán)莓色素的溶解量基本飽和，藍(lán)莓色素向提取劑的擴(kuò)散達(dá)到了平衡所致。

2.1.3 超聲溫度對(duì)藍(lán)莓色素提取率的影響

圖3 超聲溫度對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of blueberry pigments

從圖3可以看出，在料液比1:10、pH自然、超聲功率400W、超聲時(shí)間60min條件下，當(dāng)提取溫度低于50℃時(shí)，隨溫度升高藍(lán)莓色素提取率呈上升趨勢(shì)，在50℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值；隨著溫度的繼續(xù)升高，藍(lán)莓色素提取率開始下降。這可能是由于在升溫和機(jī)械波作用下，藍(lán)莓色素結(jié)構(gòu)遭到破壞，造成了提取率下降。因此，最佳提取溫度應(yīng)在50℃附近，選取50℃為自變量超聲溫度的零水平。

2.1.4 提取劑pH值對(duì)藍(lán)莓色素提取率的影響

圖4結(jié)果表明，在料液比1:10、超聲溫度50℃、超聲功率400W、超聲時(shí)間60min條件下，pH值對(duì)藍(lán)莓色素提取率有顯著影響(P＜0.05)，提取率隨pH值的升高而降低。這與藍(lán)莓色素結(jié)構(gòu)有關(guān)，其結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，呈酸性；而因其結(jié)構(gòu)中吡喃雜環(huán)上的氧原子的親電子性，使其具有堿性；兩性特征使其色調(diào)及穩(wěn)定性受pH值變化的影響較大[13]。

圖4 pH值對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of pH on extraction rate of blueberry pigments

2.1.5 超聲功率對(duì)藍(lán)莓色素提取率的影響

圖5 超聲功率對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of blueberry pigments

由圖5可知，在料液比1:10、超聲溫度50℃、pH自然、超聲時(shí)間60 min條件下，當(dāng)超聲功率小于500W時(shí)，藍(lán)莓色素提取率隨超聲功率的升高而升高，當(dāng)超聲功率大于500W時(shí)，提取率隨超聲功率的升高而增加不明顯，當(dāng)超聲功率高于700W時(shí)，藍(lán)莓色素提取率有所下降。超聲波作用的效果取決于單位面積輸出的超聲功率和提取物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，不同的提取物有著不同的適宜提取的超聲功率范圍，超過(guò)此范圍，超聲作用可能會(huì)使目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)生降解而影響其得率[14]。

2.1.6 超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓色素提取率的影響

圖6結(jié)果顯示，在料液比1:10、超聲溫度50℃、pH自然、超聲功率400W條件下，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)莓色素提取率呈先快速增加后緩慢上升的趨勢(shì)。根據(jù)Fick擴(kuò)散定律，在一定條件下，超聲時(shí)間越長(zhǎng)，擴(kuò)散的物質(zhì)越多，提取率越高，即提取率與提取時(shí)間成正比；但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，擴(kuò)散系數(shù)降低，提取率不再與時(shí)間成正比，而且會(huì)延長(zhǎng)操作周期、增加能耗。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.6 Effect of extraction duration on extraction rate of blueberry pigments

2.2 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化藍(lán)莓色素的超聲提取工藝

利用Design-Expert 7.1軟件，采用響應(yīng)面法對(duì)表2中藍(lán)莓色素提取率試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到提取率對(duì)料液比(A)、超聲溫度(B)、pH值(C)、超聲功率(D)、超聲時(shí)間(E)的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y =150.43－10.65A+10.52B+3.06C+2.32D－5.86E+ 9.66AB－20.61AC－3.33AD－4.51AE－18.14BC+4.66BD+ 9.95BE－17.10CD+7.13CE+22.27DE+7.03A2+7.57B2+ 21.64C2－0.86D2+16.73E2

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，模型的F=34.68，P＜0.0001＜0.01，說(shuō)明所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性，失擬項(xiàng)F=1.03，在P＜0.05水平上不顯著(P=0.6118＞0.05)，其校正決定系數(shù)R2Adj為0.9729，表明此模型擬合度好，試驗(yàn)誤差小，說(shuō)明可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)藍(lán)莓色素的超聲提取工藝結(jié)果。

根據(jù)回歸方程得A、B、C、D、E優(yōu)水平均為+1水平，即最佳工藝條件為料液比1:13、超聲溫度55℃、pH4.5、超聲功率450W、超聲時(shí)間50min。對(duì)優(yōu)化提取條件進(jìn)行驗(yàn)證，得實(shí)際藍(lán)莓色素提取率為274.36U/g，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為2.57%。

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis for the fitted regression model

2.3 藍(lán)莓色素的穩(wěn)定性分析

表4顯示，藍(lán)莓色素溶液為pH9.0時(shí)，貯藏期間吸光度逐漸減少；pH5.0和pH7.0條件下，藍(lán)莓色素溶液的吸光度變化不大；而在pH3.0溶液下，藍(lán)莓色素溶液的吸光度稍有增加。同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，pH3.0和pH5.0的色素溶液呈藍(lán)紫色，pH7.0的色素溶液呈紫紅色，pH9.0的色素溶液呈淺黃色。由此可見，藍(lán)莓藍(lán)紫色色素不適于在堿性環(huán)境中保存和著色。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Central composite design arrangement and experimental results

表4 p H值、溫度、食品添加劑和金屬離子對(duì)藍(lán)莓色素吸光度的影響Table4 Effects of pH, temperature, additives and metal ions on the stability of blueberry pigments

將藍(lán)莓色素溶液分別貯藏于4、85℃時(shí)，其吸光度變化差異不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明藍(lán)莓色素在低溫和高溫條件下穩(wěn)定性較高；但貯藏于25℃時(shí)，其吸光度隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，這可能與該溫度有利于花青素的聚合有關(guān)[12]。

從表4可以看出，藍(lán)莓色素于25℃貯藏時(shí)，葡萄糖、防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀對(duì)其色澤沒有顯著影響；加入抗壞血酸后，吸光度增大，對(duì)該色素起穩(wěn)定作用；而與甜味劑蔗糖共存時(shí)，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng),色素溶液的吸光度亦增大。說(shuō)明藍(lán)莓色素對(duì)被試食品添加劑有較好的穩(wěn)定性。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓色素溶液中加入ZnCl2后變?yōu)榈揖G色，加入FeCl2后變?yōu)樯罨揖G色，加入FeCl3后變?yōu)樯铧S褐色，加入CaCl2后變?yōu)辄S褐色，且均出現(xiàn)沉淀，可能是因?yàn)檫@些金屬離子與藍(lán)莓色素發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng)所致。K+、Na+和Mg2+對(duì)藍(lán)莓色素溶液吸光度沒有顯著影響(表4)。

3 結(jié) 論

藍(lán)莓色素超聲提取工藝的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、料液比1:13、超聲溫度55℃、pH4.5、超聲功率450W、超聲時(shí)間50min。此條件下藍(lán)莓色素提取率為274.36U/g。與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.57%。

藍(lán)莓色素顏色變化和穩(wěn)定性受熱、K+、Na+、Mg2+及山梨酸鉀等食品添加劑的影響較小，而在Z n2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+及堿性環(huán)境條件下不穩(wěn)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]李明瑾, 林松毅, 王二雷, 等. 篤斯越桔花青素的分離純化研究[J].食品科學(xué), 2007, 28(11): 139-141.

[2]KALT W, DUFOUR D. Health functionality of blueberries[J]. Horticulture Technology, 1997, 7(3): 216-221.

[3]FARIA A, PESTANA D, MONTEIRO R, et al. Influence of anthocyanins and derivative pigments from blueberry (Vaccinium myrtillus) extracts on MPP+intestinal uptake: A structure-activity approach[J]. Food Chemistry, 2008, 109(3): 587-594.

[4]FARIA A, OLIVEIRA J, NEVES P, et al. Antioxidant properties of prepared blueberry (Vaccinium myrtillus) extracts[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2005, 53(17): 6896-6902.

[5]KALT W, BLUMBERG J B, McDONALD J E, et al. Identification of anthocyanins in the liver, eye, and brain of blueberry-fed pigs[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2008, 56(3): 705-712.

[6]NORTON C, KALEA A Z, HARRIS P D. Wild blueberry-rich diets affect the contractile machinery of the vascular smooth muscle in the Sprague -Dawley rat[J]. Journal of Medical Food, 2005, 8(1): 8-13.

[7]LAPORNIK B, PROSEK M, WONDRA A G. Comparison of extracts prepared from plant by-products using different solvents and extraction time[J]. Journal of Food Engineering, 2005, 71(2): 214-222.

[8]CHEN Fang, SUN Yangzhao, ZHAO Guanghua. Optimization of ultrasound-assisted extraction of anthocyanins in red raspberries and identification of anthocyanins in extract using high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2007, 14 (6): 767-778.

[9]姜峰, 趙燕禹, 姜梅蘭, 等. 功率超聲在中藥提取過(guò)程中的應(yīng)用[J].化工進(jìn)展, 2007, 26(7): 944-948.

[10]KWON C M. Application of central composite design to simulation experiment[J]. Lecture Notes in Computer Science, 2005, 3398: 40-49.

[11]趙彥杰. 樹脂法提取高灌藍(lán)莓果色素的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29 (8): 306-309.

[12]劉翠, 陳素華, 陳少云, 等. 中國(guó)野生篤斯越橘花青素的初步分離和分析[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2009, 25(1): 57-64.

[13]CORRALES M, TOEPFL S, BUTZ P, et al. Extraction of anthocyanins from grape by-products assisted by ultrasonics, high hydrostatic pressure or pulsed electric fields: A comparison[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2008, 9(1): 85-91.

[14]MARTINEZ K, BARCELO D. Determination of antifouling pesticides and their degradation products in marine sediments by means of ultrasonic extraction and HPLC-APCI-MS[J]. Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 2001, 370(7): 940-945.

Ultrasonic-aided Extraction and Stability Assessment of Blueberry Pigments

YANG Xue-fei，PAN Li-hua，LUO Jian-ping*
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The ultrasonic-aided extraction of blueberry pigments was optimized by single-factor and central composite design methods. Besides, the stability of blueberry pigments under different environmental conditions was also measured. The optimal conditions for the extraction of blueberry pigments were found to be: extraction solvent, 45% alcohol; ultrasonic power, 450 W; material/liquid ratio, 1:13, extraction temperature, 55 ℃, extraction duration, 50 min; and pH 4.5. The extraction rate of blueberry pigments was 3.26% under these optimal conditions. Blueberry pigments were thermostable. The stability of blueberry pigments was good in the respective presence of K+, Na+and Mg2+and potassium sorbate, while Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ca2+and alkaline condition could damage their stability.

blueberry；ultrasonic-aided extraction；natural pigment；stability；central composite design

TS202.3

A

1002-6630(2010)20-0251-05

2010-06-30

合肥工業(yè)大學(xué)博士專項(xiàng)(2010HGBZ0296)

楊雪飛(1973—)，女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)。E-mail：yangxuefei2000@126.com

*通信作者：羅建平(1966—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橹胁菟幣c功能食品化學(xué)。E-mail：jianpingluo@yahoo.com.cn