董 翠,陰志剛,王純耀#,張旭東

1)鄭州大學(xué)生物工程系鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科鄭州 450052

#通訊作者,男,1962年11月生,教授,研究方向:分子生物學(xué),E-mail:chunyao@zzu.edu.cn

端粒是真核細(xì)胞染色體末端的重復(fù)DNA序列,其生物學(xué)功能是防止染色體 DNA降解、末端融合、非正常重組和染色體的缺失[1]。端粒由端粒酶合成。人端粒酶主要由2部分組成,即端粒酶RNA模板和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)[2]。端粒酶是腫瘤細(xì)胞特異的蛋白酶,90%以上的腫瘤細(xì)胞有端粒酶活性,而絕大多數(shù)正常細(xì)胞則檢測(cè)不到或活性極低[3]。hTERT的轉(zhuǎn)錄水平和腫瘤的端粒酶活性密切相關(guān),因此hTERT的啟動(dòng)子有可能成為一個(gè)靶向腫瘤的特異性啟動(dòng)子[4]。根據(jù)這一特點(diǎn),作者克隆了hTERT的啟動(dòng)子,將其構(gòu)建到真核熒光表達(dá)載體pEGFP-C3上,取代其原有的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子,并檢測(cè)其功能,為后續(xù)的腫瘤靶向性治療奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 基因組DNA小量抽提試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒和PCR清潔試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司產(chǎn)品,T4連接酶和限制性內(nèi)切酶為TaKaRa公司產(chǎn)品,LA Taq DNA聚合酶和pGEM-TEasy載體為Promega公司產(chǎn)品,DMEM細(xì)胞培養(yǎng)粉為Gibco公司產(chǎn)品,胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司,脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。真核熒光表達(dá)載體pEGFP-C3為鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心與韓志強(qiáng)教授合作實(shí)驗(yàn)室保種,其原有多克隆序列已通過(guò) BglⅡ和HpaⅠ雙酶切去除。大腸桿菌E.coli Top10和DH5α及人胚腎 293A細(xì)胞由鄭州大學(xué)韓志強(qiáng)教授惠贈(zèng)。

1.2 hTERTp引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank所提供的hTERT基因的序列設(shè)計(jì)引物,上游引物5'-ATTCGCGGGCACAGACGCCCAGGACCGCGC-3',下游引物5'-CGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCT TCCCA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小為276 bp。引物不含酶切位點(diǎn),在表達(dá)載體pEGFP-C3上引入AseⅠ、SpeⅠ、NotⅠ、NdeⅠ、NruⅠ和AgeⅠ酶切位點(diǎn)。引物和多克隆位點(diǎn)由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 hTERTp的PCR擴(kuò)增 使用基因組DNA小量抽提試劑盒,按照操作說(shuō)明從 293A細(xì)胞中提取人基因組DNA,以人基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增hTERTp。反應(yīng)體系:2×GC Buffer 25μL,dNTPmix 6μL,人基因組DNA 3μL,上、下游引物各1μL,LA Taq酶0.5μL,ddH2O 13.5μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min;95℃30 s,62℃30 s,72℃1 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸6 min。10 g/L的瓊脂糖凝膠鑒定克隆產(chǎn)物為所需目的基因后,使用DNA膠回收試劑盒回收hTERTp。

1.4 目的基因與 T載體的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定 膠回收的hTERTp用10 g/L的瓊脂糖凝膠定量,然后與pGEM-T Easy載體連接,連接體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli Top10,在氨芐青霉素陽(yáng)性LB平板上經(jīng)藍(lán)白斑篩選。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和NotⅠ單酶切鑒定,并送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.5 重組載體pEGFP-C3的構(gòu)建及鑒定 用AseⅠ和AgeⅠ雙酶切質(zhì)粒pEGFP-C3,去除載體原來(lái)的CMV啟動(dòng)子,10 g/L的瓊脂糖凝膠鑒定后回收目的片段。將合成的多克隆位點(diǎn)兩鏈退火,連接到 pEGFP-C3去除CMV啟動(dòng)子的膠回收片段上,連接體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α,并接種于卡那霉素陽(yáng)性平板上。重組pEGFP-C3質(zhì)粒分別經(jīng)NotⅠ、NdeⅠ酶切鑒定。

1.6 pEGFP-C3-hTERTp載體的構(gòu)建及鑒定NotⅠ酶切重組真核表達(dá)載體pEGFP-C3和pGEM-hTERTp,膠回收hTERTp和pEGFP-C3雙黏片段。將hTERTp與去磷酸化載體pEGFP-C3用T4連接酶連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α,并接種于卡那霉素陽(yáng)性LB平板上。重組載體經(jīng)PCR鑒定,并集菌送測(cè)序。

1.7 重組表達(dá)載體pEGFP-C3-hTERTp轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前 1 d,取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的 293A細(xì)胞接種到 6孔板,使轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞匯合度達(dá)到90%～95%。用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,設(shè)pEGFP-C3轉(zhuǎn)染組為陽(yáng)性對(duì)照,按試劑說(shuō)明操作。轉(zhuǎn)染 48～72 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況并照相。

2 結(jié)果

2.1 hTERTp的PCR擴(kuò)增結(jié)果 見圖1。擴(kuò)增的276 bp條帶與預(yù)期相符。

圖1 hTERTp的PCR擴(kuò)增結(jié)果M:DNA Marker;1:hTERTp。

2.2 克隆載體pGEM-hTERTp的鑒定 pGEM-hTERTp菌落PCR鑒定結(jié)果見圖2。NotⅠ酶切克隆載體pGEM-hTERTp,得到310 bp的目的基因和2 981 bp的線狀片段(圖3)。

2.3 重組載體pEGFP-C3的鑒定 AseⅠ和AgeⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pEGFP-C3得到593 bp的CMV啟動(dòng)子片段和3 955 bp的載體片段(圖4)。重組載體引入多克隆序列,經(jīng)NotⅠ和NdeⅠ分別單酶切均得到3 986 bp的線性載體片段,與預(yù)期結(jié)果相符(圖5)。

2.4 重組表達(dá)載體pEGFP-C3-hTERTp的鑒定

重組表達(dá)載體pEGFP-C3-hTERTp菌落PCR鑒定結(jié)果見圖6。

圖6 重組表達(dá)載體

2.5 重組表達(dá)載體pEGFP-C3-hTERTp在真核細(xì)胞中的表達(dá) 見圖7。

圖7 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞(×100)A:pEGFP-C3-hTERTp轉(zhuǎn)染組;B:陽(yáng)性對(duì)照。

3 討論

端粒酶在大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中處于激活狀態(tài),而在正常細(xì)胞中卻失活,并且其活性高低與腫瘤惡化程度有關(guān),是目前所報(bào)道的最廣譜的腫瘤生物分子標(biāo)記[5]。目前已發(fā)現(xiàn)的端粒酶組分中,只有hTERT在端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá),且表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞端粒酶的活性一致[6],提示hTERT啟動(dòng)子可能是一個(gè)好的腫瘤特異性啟動(dòng)子,以hTERT啟動(dòng)子調(diào)控腫瘤治療基因,可以達(dá)到靶向腫瘤基因治療的目的。

作者采用PCR方法擴(kuò)增了包含核心區(qū)的276 bp的hTERTp片段,并用其取代真核熒光表達(dá)載體pEGFP-C3原有CMV啟動(dòng)子,構(gòu)建重組載體pEGFPC3-hTERTp。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染端粒酶陽(yáng)性的人胚腎293A細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)hTERTp能夠啟動(dòng)綠色熒光蛋白GFP基因的表達(dá)。該研究為應(yīng)用hTERTp作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,調(diào)控不同作用機(jī)制的治療基因在多種腫瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá),實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性基因治療奠定了基礎(chǔ)。

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