人 PTEN基因 RNA干擾及其 RESC救援慢病毒載體的構建與鑒定

王玉梅1,2,3)△,盛光耀1)
1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院兒科鄭州 450052 2)鄭州大學第三附屬醫(yī)院兒內(nèi)科鄭州 450052 3)美國圣路易斯華盛頓大學醫(yī)學院血液系密蘇里州 63110-1093
△女,1962年 11月生,博士研究生,主任醫(yī)師,研究方向：小兒血液病 /腫瘤學,E-Mail：wangyuMei15@yahoo.com.cn

PTEN基因;慢病毒載體;RNA干擾;逃避 RNA干擾策略結構;脫靶效應

目的： 構建人 PTEN基因RNA干擾(RNA i)及其逃避RNA i策略結構(RESC)救援的慢病毒載體。方法：利用 Invitrogen公司在線軟件,針對已篩選確定的 PTEN基因 RNA i有效靶序列,設計并合成靶序列的 o ligoDNA,退火形成雙鏈DNA,與經(jīng) XbaⅠ和 XhoⅠ酶切后的 pFLRu-GFP載體連接構建成 pFLRu-U6-shPTEN慢病毒載體。在此基礎上,引入外源設計的 PTEN mRNA,與經(jīng) Eco RⅠ和BaMHⅠ酶切后的 pFLRu-U 6-shPTEN載體連接,從而產(chǎn)生在同一個載體內(nèi)兼有人 PTEN基因 shRNA及其救援 cDNA同時表達的 RESC慢病毒載體 pFLRu-U 6-rrshPTEN。2者均轉入到大腸桿菌 XL10感受態(tài)細胞,制備質粒并用酶切及測序鑒定。分別用 pFLRu-U 6-shPTEN、pFLRu-U 6-rrshPTEN與 pCMV-dR8.2ΔR和 pCMV-VSV-G質粒共轉染 293T包裝細胞,包裝產(chǎn)生 2種慢病毒,收集病毒上清,系列稀釋法檢測病毒懸液的滴度。結果：氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆、酶切鑒定、U 6前引物測序鑒定結果顯示p FLRu-U6-shPTEN和 p FLRu-U 6-rrshPTEN均為陽性克隆,且 2種慢病毒的滴度分別為 6.6×105和 5.6×105p fu/mL。結論：成功構建出人 PTEN基因RNA i及其RESC慢病毒載體。有效地避免了由于脫靶效應所引起的假陽性結果對實驗的干擾,為研究 PTEN基因功能提供了穩(wěn)定的轉染細胞載體。

與張力蛋白同源的 10號染色體缺失的磷酸酶基因[1](phosphatase and tensin homo logue deleted on chromosoMe ten gene,PTEN),是具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因,它的缺失和失活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[2-3]。RNA干擾 (RNA interference, RNA i)技術可高效、特異地下調(diào)目標基因的表達,在基因功能研究和基因治療領域有著廣闊的應用前景,為研究內(nèi)源性基因功能和信號轉導途徑提供了強有力的研究工具[4]。但是在 RNA i過程中常有“脫靶效應”的發(fā)生,從而造成實驗假陽性結果[5-6]的出現(xiàn)。該研究旨在構建 PTEN基因的 RNA i及其逃避 RNA i策略結構[7](RNA i escape strategy construct,RESC)救援的慢病毒載體并進行鑒定,它有效地避免了因“脫靶效應”所造成的假陽性結果對實驗的干擾,為 PTEN基因的功能研究提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料 pFLRu-GFP載體在 pB luescrip t(購自Invitrogen公司)基礎上,加入綠色熒光蛋白 (GFP)、Flag-H is標簽、血細胞凝集素和嘌呤霉素內(nèi)部核糖體進入位點等構建而成。PTEN基因的慢病毒干擾片段、所用引物,采用 Invitrogen網(wǎng)站上的免費軟件設計并由美國 Integrated DNA Techno logies( IDT)公司合成。高糖DMEM培養(yǎng)基、MEMA lpha培養(yǎng)基和胎牛血清 (FBS)購自 Gibco公司。質粒提取試劑盒,膠回收試劑盒,PCR擴增試劑盒,Op ti-MEM培養(yǎng)基,TRANSIT,pCMV-dR8.2ΔR,pCMV-VSV-G,限制性內(nèi)切酶 XbaⅠ、XhoⅠ、B aMHⅠ和 Eco RⅠ,T4DNA連接酶,胰蛋白酶均購自 Invitrogen公司。魚精蛋白購自 SigMa公司。293T細胞株購自 Invitrogen公司,由美國圣路易斯華盛頓大學醫(yī)學院血液學實驗中心傳代培養(yǎng)。大腸桿菌 XL10感受態(tài)細胞由美國圣路易斯華盛頓大學醫(yī)學院血液學實驗中心制備。

1.2 PTEN基因 RNA i慢病毒載體的構建 試驗過程包括 3個連續(xù)的步驟。第 1步 PCR用引物 5’-ACAGAATTCTAGAACCCCAGTGGAAAG ACGCGCAG-3’(正義鏈 U f1)、5’-GGTGTTTCGTCCTTTCCA CAAG-3’(反義鏈U r1),模板 pBS-hU 6-1,擴增出含hU 6啟動子 (含 XbaⅠ酶切位點)的寡核苷酸片段(f1)。用 10 g/L TAE瓊脂糖凝膠、凝膠純化試劑盒回收預期 340 bp大小的 PCR產(chǎn)物片段。第 2步PCR使用配對引物 Cf1、C r1(表 1)擴增出能使PTEN基因沉默的 shRNA(含 XhoⅠ酶切位點)片段(f2)。用 120 g/L TAE聚丙烯酰胺凝膠純化,回收80 bp的 PCR產(chǎn)物片段。第 3步 PCR用U f1、Cr1作引物,f1和 f2的混合物作模板,擴增出 U 6-shPTEN片段,用 10 g/L TAE瓊脂糖凝膠、凝膠純化試劑盒回收 420 bp大小的 PCR產(chǎn)物片段 (f3)。之后用pFLRu-GFP作載體,f3作為插入片段,用 XbaⅠ/ XhoⅠ酶切,分別回收并純化 9000及 420 bp片段。用 T4DNA連接酶連接后,將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌 (E.co li)XL10感受態(tài)細胞,涂布氨芐青霉素抗性 (100 Mg/L)平板,37℃過夜培養(yǎng)。對陽性克隆提取質粒;用 XbaⅠ/XhoⅠ/B aMHⅠ酶切對質粒初步鑒定,選擇有 9000、1 200和 420 bp片段的質粒測序。U 6前引物測序驗證,序列為 5′-GTTGGCGAGT GTGTTTTGTGAAG-3′。

1.3 PTEN基因 RESC救援慢病毒載體的構建

通過 3步 PCR從人類 PTEN基因的 cDNA擴增出PTEN蛋白的全長編碼區(qū)。前 2步 PCR分別用CF1/CR1和 CF2/CR2(表 1)作引物,其中引物 CR1 和CF2包含 4個點同義突變,人 PTEN cDNA(Thermo Scien tific公司,美國)作模板擴增出對應 shRNA位置有同義突變的、大小為 650 bp(F1)和 560 bp (F2)的 2段 MRNA片段,用 10 g/L TAE瓊脂糖凝膠回收 F1和 F2。第 3步 PCR用 CF1和 CR2作引物,F1和 F2的混合物作模板擴增出在 PTEN的 shRNA序列對應的位置含有同義突變的突變后的全長片段 (F3),回收預期為 1 200 bp左右 PCR產(chǎn)物片段。pFLRu-U 6-shPTEN作載體,F3為插入片段,用上述方法把 F3片段亞克隆到 pFLRu-U 6-shPTEN質粒的 Eco RⅠ/B aMHⅠ酶切位點。陽性克隆經(jīng)XbaⅠ/XhoⅠ/Eco RⅠ/BaMHⅠ酶切初步鑒定,選擇有 9000、1 200和 420 bp片段的質粒測序鑒定。測序上游引物：5′-GTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAG-3′;測序下游引物：5′-CTGAGGATCCTTTGATT GAAGAGCTTTCTTTATG-3′。

1.4 慢病毒的包裝和滴度測定 用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞,細胞密度為15×106L-1時重新接種于直徑10cm的細胞培養(yǎng)皿,37℃、體積分數(shù) 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),細胞達 70%融合時進行轉染。用Op ti-MEM培養(yǎng)基,在 TRANSIT介導下,使用慢病毒包裝質粒pCMV-dR8.2ΔR和pCMVVSV-G混合物(質量比8：1混合)分別與慢病毒質粒 pFLRu-U 6-shPTEN和 pFLRu-U 6-rrshPTEN共轉染 293T細胞;轉染后24 h用含體積分數(shù) 10%FBS 的MEMA lpha培養(yǎng)基對細胞進行換液處理;轉染后48 h收集細胞上清,1 200 r/Min離心5min,然后使用0.45μm的過濾器過濾上清液。慢病毒貯液梯度稀釋 (10-1～10-6)。剩余病毒-80℃保存?zhèn)溆?。DMEM培養(yǎng)液重懸 N IH3T3細胞至 4×106L-1,在96孔板每孔中加100μL重懸細胞、45μL病毒顆粒稀釋液,感染細胞,37℃溫育8 后,更換含體積分數(shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。倒置熒光顯微鏡下檢測 GFP表達量,病毒滴度為表達 GFP的細胞數(shù)乘以相應稀釋倍數(shù)。

2 結果

2.1 雙鏈寡核苷酸的合成 將針對目標基因PTEN特異性的干擾單鏈寡核苷酸行退火處理,得到雙鏈寡核苷酸產(chǎn)物(圖 1)。

圖1 PTEN基因干擾片段雙鏈寡核苷酸電泳圖M：Marker;1：PTEN基因的干擾片段。

2.2 pFLRu-U6-shPTEN和 pFLRu-U6-rrshPTEN陽性克隆測序鑒定 測序及在 GenBank數(shù)據(jù)庫B last分析與其他基因的同源性后,證實所得結果與實驗要求的 DNA序列完全一致,提示 pFLRu-U 6-shPTEN和 p FLRu-U 6-rrshPTEN均為陽性克隆。

2.3 慢病毒載體的包裝及滴度測定 測得 pFLRu-U6-shPTEN和 pFLRu-U6-rrshPTEN2種慢病毒的病毒滴度分別為6.0×105和5.0×105pfu/mL。說明有大量質粒轉入 293T細胞,病毒成功包裝。

3 討論

PTEN基因[1]定位于染色體 10q23.3,由 9個外顯子和 8個內(nèi)含子構成,其 cDNA序列包含由1 209個核苷酸組成的開放閱讀框架,編碼 403個氨基酸組成的蛋白質,其編碼產(chǎn)物具有雙重磷酸酶活性。PTEN作用于AKT信號傳導通路的中心環(huán)節(jié),通過脂質磷酸酶活性抑制 PI3K的磷酸化,阻斷AKT/蛋白激酶B(PKB)途徑,在胞質細胞信號傳遞誘導凋亡、介導 G1期停滯、影響基因的表達、抑制細胞遷移、浸潤和整合素介導的細胞鋪展及局部黏附等過程中起著重要作用[8]。它通過抑制 pMAK細胞信號傳導途徑抑制細胞生長分化[9]。因此 PTEN在正常表達時可抑制腫瘤細胞生長、遷移及浸潤。PTEN的突變或雜合丟失可導致 PTEN編碼蛋白表達缺失,從而導致某些惡性腫瘤的發(fā)生[2-3]。

RNA i由于能夠高效率、特異性地下調(diào)靶基因表達,已被證明是一個在內(nèi)源性基因功能研究領域的有效工具,已成為分子生物學研究的常規(guī)技術。慢病毒載體是一種復制缺陷型逆轉錄病毒載體,以H IV-1為基礎發(fā)展而得[10-11],能夠轉染非分裂期細胞和分裂期細胞,還能將病毒的遺傳物質整合到宿主細胞的基因組,感染后細胞可以穩(wěn)定持續(xù)表達目的基因[12-13],是基因功能研究和基因治療中不可多得的優(yōu)良載體。然而隨著 RNA i技術的應用,越來越多的證據(jù)[5-6]表明“脫靶效應”在 RNA i中廣泛存在,它使實驗出現(xiàn)假陽性結果,直接影響了實驗結果的準確性。為了避免“脫靶效應”的干擾,作者在研究中引入救援機制,根據(jù)氨基酸的簡并性,在核苷酸水平上改變靶基因,使其基因表達的天然蛋白編碼不變,同時又能妨礙 RNA i沉默,從而允許救援。構建出的RESC救援慢病毒載體引入RNA i實驗中,如果能恢復由 RNA i引起的變化,則可以排除因 shRNA的脫靶效應所引起的假陽性結果。

該研究中,作者用 PTEN基因作為靶基因,系統(tǒng)地論述了構建 RNA i及其 RESC救援慢病毒載體體系的實驗過程。構建 RNA i慢病毒載體時,根據(jù)Tusch l[14]設計原則,設計合成了 1對能表達 PTEN基因的 shRNA單鏈寡核苷酸,GC含量在 35%～55%。中間添加 Loop結構 (TTCAAGAGA)。以堿基“G”開始,到“TTTTT”終止,使質粒轉染到細胞后轉錄從“G”開始。通過運用 2個重疊的單鏈寡核苷酸的 PCR合成了 shRNA的DNA模板。然后將這個基因片段與 hU 6啟動子融合并克隆到慢病毒載體 pFLRu-GFP中,從而得到 pFLRu-U6-shPTEN載體。構建 RESC救援慢病毒載體時,針對 PTEN基因的mRNA序列對應的 shRNA位置引入 4個點同義突變,使 shRNA不能作用于這種“外源”設計的mRNA。同義突變(CR2)滅活 PTEN基因 cDNA的終止密碼子。在其兩端分別加入酶切位點,以便基因操作及識別。把這個具有抗 shRNA的基因片段與 GFP融合后亞克隆到慢病毒載體 pFLRu-U 6-shPTEN中,得到一個載體內(nèi)既有 shRNA的表達,又有抗RNA i的 cDNA表達的 RESC救援慢病毒載體pFLRu-U 6-rrshPTEN。

該研究中所開發(fā)構建的 RNA i及其 RESC救援慢病毒載體體系有以下優(yōu)點：①該研究所使用的慢病毒載體可轉染體內(nèi)非分裂期、休眠期細胞或體外生長阻止細胞;帶有目的基因的遺傳物質能夠整合到宿主基因組中,同時能夠穩(wěn)定表達[13]。②siRNA通過細胞內(nèi)轉錄生成,而不是化學合成或體外轉錄。這是一個在 RNA i表達中 siRNA合成的便捷的方法。③抗 siRNA目的基因的 cDNA與 shRNA表達在同一個載體中,用來恢復實驗中由 RNA i引起的表型改變。雖然作者的慢病毒載體體系并沒有消除潛在的“脫靶效應”,它卻能夠明確判斷實驗中表型改變是由 siRNA誘導沉默引起或所謂的“脫靶”的效果。因此,在該研究中提出的構建 RNA i及其RESC救援慢病毒載體的體系在基因功能研究中具有普遍的適用性。

總之,作者通過酶切、測序等篩選出 PTEN基因RNA i的有效靶序列后,應用 293T細胞作為包裝細胞,在包裝后產(chǎn)生了高滴度的病毒顆粒,同時表達報告基因 GFP。結果表明,成功構建了含有 GFP報告基因的 PTEN基因的 RNA i慢病毒載體及其 RESC救援慢病毒載體,為進一步研究 PTEN基因功能并探討其在細胞遷移過程中的機制奠定了基礎。

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(2009-12-02收稿 責任編輯姜春霞)

可能已具有了某種人格特質和生物學基礎,從而成為焦慮障礙發(fā)生的易感素質,在生活事件和不良社會環(huán)境共同作用下,導致了焦慮障礙的發(fā)生。

致謝 感謝香港中文大學張妙清教授、中國科學院心理研究所張建新教授提供了量表和悉心指導!

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(2009-06-12收稿 責任編輯王 曼)

Construction and identification knockdown and RESC concurrent rescue of RNA i lentiviral vector on human PTEN gene

WANG YuMei1,2,3),SHENG Guangyao1)

1)D epartMen t of Ped ia trics,the First Affilia ted Hospita l,Zhengzhou Un iversity,Zhengzhou 450052 2)D epartMen t of Ped ia trics,the Th ird Affilia ted Hospita l,Zhengzhou University,Zhengzhou 450052 3)D ivision of HeMa tology,Schoo l of Med icine,W ashing ton University in St.Louis,MO 63110-1093

PTEN gene;lentiviral exp ression vector;RNA interference;RNA interference escape strategy construct; off-target effect

A im：To construct the lentiviral exp ression vectors of huMan PTEN fo r RNA i and for concurrent rescue of RNA i escape strategy construct(RESC).Me thods：PTEN shRNA sequence of huMan was designed by on-line designer software on Co rp. Invitrogen.A fter synthesis and annealing,doub le strand o ligonuc leo tides(dso ligoes)that d igested w ith XbaⅠand XhoⅠwere cloned into the pFLRu-GFP p lasMid and lentiviral exp ression vector of pFLRu-U 6-shPTEN was obtained.Based on pFLRu-U 6-shPTEN,exogenousmRNA of PTEN were d rawn into RNA i,and the vector of coMbining the exp ression of shRNA and rescue cDNA in the saMe vector pFLRu-U 6-rrshPTEN were gotten after being digested w ith Eco RⅠand BaMHⅠenzyMes.Theywere then transfor Med into cheMically competent E.coli XL10b lue bacteria.And after identification by sequencing and digestion,293T cell line was transfected by above positive recoMbined p las Mids and len tiviral packingMaterials pCMV-dR8.2ΔR and pCMV-VSV-G p lasMids.Theywere incubated for 48 to 72 h in a 37℃,5% CO2incubator.Cu lture supernatantwas harvested and stored at-80℃,then the virus titerwas deter Mined by serial dilution assay.Resu lts： It was showed that all the p las Mids,recoMbinant vectors pFLRu-U 6-shPTEN and pFLRu-U 6-rrshPTEN,were positive c lone vecto rs after screening positive c lones by aMp icillin,d igested and sequenced by the use of p riMer for ward ofU 6 p riMer.Conc lusion：Lentiviral shRNA exp ression vector and RESC vecto r coMbining the exp ression of shRNA and concurrent rescue cDNA in the saMe vector are successfu lly constructed.They obviate to Misinterp retation of phenotypes as a result of false-positive responses by off-target effectively and p rovide the stable transfection vectors for research on PTEN gene.

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