高個(gè)體識(shí)別力通用單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)篩選及檢測(cè)＊

曾昭書(shū)1)△,王 黎2),方 宇3),張書(shū)紅1),張廣政1),郭克民1)
1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科鄭州 450052
△男,1973年 5月生,博士,副教授,研究方向：法醫(yī)物證學(xué),E-Mail：zzs@zzu.edu.cn

個(gè)體識(shí)別;單核苷酸多態(tài)性;rs4607417;rs749305;焦磷酸測(cè)序

目的： 在全基因組中查找能夠在世界各大人群中通用的高個(gè)體識(shí)別力單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn),以期為 SNPs應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別奠定基礎(chǔ)。方法：從國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖計(jì)劃 (HapMap)數(shù)據(jù)庫(kù)下載 270名個(gè)體各約 4 000 000個(gè)全基因組 SNPs分型數(shù)據(jù),運(yùn)用自主編寫(xiě)的計(jì)算機(jī)程序,按照較小等位基因頻率 (MAF)≥0.45的原則提取在中國(guó)北京漢族人群、日本東京人群、尼日利亞約魯巴人群以及美國(guó)白人人群中同時(shí)存在的 SNPs,以焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)其中的 rs4607417和 rs749305在河南漢族人群 (n=144)中進(jìn)行群體遺傳學(xué)調(diào)查,計(jì)算 Hardy-W einberg平衡概率 (HW P)、雜合度(Het)、多態(tài)信息含量 (PI C)和個(gè)體識(shí)別力 (DP),并與 HapMap的數(shù)據(jù) (n=45)進(jìn)行比較。結(jié)果：共找到 1 439個(gè)通用的 SNPs。在河南漢族人群中,rs4607417和 rs749305的 HW P分別為 0.872和0.423,Het分別為 0.476和 0.524,PI C分別為 0.384和 0.388,DP分別為 0.616和 0.612。與 4個(gè)人群相比,僅在rs4607417上其等位基因頻率與日本東京人群差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=5.068,P=0.024)。結(jié)論：rs4607417和rs749305是通用的高個(gè)體識(shí)別力 SNPs;前述篩選獲得的 1 439個(gè) SNPs具有高度可靠性和可信度,可用作在世界各人群中通用的個(gè)體識(shí)別核心 SNPs。

單核苷酸多態(tài)性 (single nuc leotide po lymorphis Ms,SNPs)是一種重要的基因多態(tài)性,約占人基因多態(tài)性的 80%。與法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的短串聯(lián)重復(fù)序列(STRs)相比,SNPs突變率更低,等位基因更少,且擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度更短[1],其在個(gè)體識(shí)別、祖先信息推斷、宗系信息推斷和表型信息推斷等方面有重要的應(yīng)用價(jià)值[2]。個(gè)體識(shí)別 SNPs(ind ividual identification SNPs,IISNPs)是指那些可用于個(gè)體識(shí)別的 SNPs。SNPs能夠應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別的原理在于對(duì)大量非連鎖的 SNPs而言,不同個(gè)體間能在這些位點(diǎn)上擁有完全一致的基因型的幾率極低[2]。目前這方面的研究較多[3-4],但仍缺乏一套能在多人群中通用的 IISNPs,阻礙了實(shí)際應(yīng)用。該研究依托國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖計(jì)劃(HapMap)數(shù)據(jù)庫(kù),運(yùn)用自主開(kāi)發(fā)的計(jì)算機(jī)程序篩選在中國(guó)北京漢族人(HCB)、日本東京人 (JPT)、尼日利亞約魯巴人(YR I)以及有歐洲血統(tǒng)的美國(guó)白人(CEU)中通用的IISNPs,并對(duì)其中的 2個(gè) IISNPs在大樣本量河南漢族人中進(jìn)行群體遺傳學(xué)調(diào)查,以驗(yàn)證其個(gè)體識(shí)別力和篩選結(jié)果的可信度。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)發(fā)掘與 SNPs篩選 HCB(n=45)、JPT (n=45)、YR I(n=60)和 CEU(n=60)各人群的全基因組 SNPs分型數(shù)據(jù)下載自 HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)(版本r21a,http：//hapMap.ncbi.nlm.nih.gov/)。以應(yīng)用程序可視化語(yǔ)言編寫(xiě)一套程序,自動(dòng)提取 4個(gè)人群中所有較小等位基因頻率(MAF)≥0.45的 SNPs及在MAF≥0.45限定下 4個(gè)人群共享的 SNPs。用Pow erstats軟件包計(jì)算雜合度 (Het),用 Genepop 4.0軟件包計(jì)算族群間遺傳分化指數(shù) (Fst)。進(jìn)一步考察軟件提取結(jié)果,以彼此間無(wú)連鎖不平衡、Hardy-W einberg平衡概率 (HW P)及側(cè)翼序列 GC含量居中等指標(biāo)篩選出 rs4607417和 rs749305 2個(gè) IISNPs供實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品 收集 144份無(wú)血緣關(guān)系的健康河南漢族個(gè)體外周血(每份 2 ML),男女各半,以酚-氯仿法提取DNA。對(duì)照DNA為 9947A和 K562,分別購(gòu)自美國(guó)AB公司和 ProMega公司。

1.3 PCR擴(kuò)增 以 Pyrosequencing AB公司提供的軟件設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增 rs4607417和 rs749305,序列見(jiàn)表 1。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成與純化。使用 AB I 9700型 PCR儀,總反應(yīng)體系50μL,含 Ho tstart Taq DNA聚合酶 2 U,模板 DNA 10～20 ng,引物各 0.20μmo l/L。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 3 Min;94℃20 s,60℃20 s,72℃30 s,共45個(gè)循環(huán);72℃延伸 5 Min;4℃保存。

1.4 焦磷酸測(cè)序[5-7]PCR引物中 1條的 5’端標(biāo)記生物素,用于制備測(cè)序反應(yīng)的單鏈DNA模板 (表1)。采用 Pyrosequencing AB公司試劑盒,參照說(shuō)明書(shū)制備單鏈DNA模板和進(jìn)行實(shí)時(shí)焦磷酸測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)在 PSQ96全自動(dòng)焦磷酸測(cè)序儀上進(jìn)行,主要步驟包括測(cè)序引物擴(kuò)增和噴射測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)結(jié)果由 PSQ96MA軟件自動(dòng)分析處理和判定基因型。

表1 相關(guān)序列

1.5 觀(guān)測(cè)指標(biāo) 直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因頻率。用Pow erstats軟件包計(jì)算 HW P、Het、多態(tài)信息含量(PIC)、個(gè)人識(shí)別力 (DP)、偶合概率 (MP)、非父排除率(PE)及典型父權(quán)指數(shù) (TPI)等指標(biāo)。以 Genepop 4.0軟件包計(jì)算北京漢族與河南漢族間的亞群近交系數(shù) (Fis)。以 SNPSTATS軟件在線(xiàn)計(jì)算 (http：//bioinfo.iconco logia.net/snp stats/start.htm)各位點(diǎn)之間的連鎖不平衡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用χ2檢驗(yàn)比較河南漢族與HapMap各人群在 2個(gè) IISNPs上的等位基因頻率分布的差異,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SNPs篩選結(jié)果 在CEU、HCB、JPT和 YR I人群中篩選出 MAF≥0.45的 SNPs各 218 883、203 302、204 444和 209467個(gè);其中 1 439個(gè) IISNPs同時(shí)存在于 4個(gè)人群中。該 1 439個(gè) IISNPs的平均Het為 0.500,平均 Fst值為 -0.006 18。

2.2 2個(gè) IISNPs的分型結(jié)果及其在河南漢族人群中的群體遺傳學(xué)參數(shù) 144例樣品中各有 143例測(cè)序結(jié)果明確,各有 1例測(cè)序結(jié)果不肯定。rs4607417 和 rs749305在河南漢族人群中的群體遺傳學(xué)參數(shù)見(jiàn)表 2。河南漢族人(n=143)和 HapMap北京漢族人 (n=45)的 Fis值見(jiàn)表 3。2個(gè)位點(diǎn)之間連鎖分析結(jié)果：D’或 r2值均小于 0.30,2個(gè)位點(diǎn)間未見(jiàn)連鎖不平衡。

表2 rs4607417和 rs749305在河南漢族人群中的群體遺傳學(xué)參數(shù)(n=143)

表3 河南漢族人和北京漢族人的 F is值

2.3 河南漢族與 HapMap各人群在 2個(gè) IISNPs上的等位基因頻率分布比較 見(jiàn)表 4、5。

表4 河南漢族與 HapMap各人群在 rs4607417上的等位基因頻率分布比較

表5 河南漢族與 HapMap各人群在 rs749305上的等位基因頻率分布比較

3 討論

運(yùn)用 SNPs進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別的原理在于：假設(shè) 1個(gè) IISNP有 2個(gè)等位基因A、G,那么在人群中將存在3種基因型AA、AG和 GG;如同時(shí)檢測(cè)20個(gè)這樣的互不連鎖的 S NPs,那么 2個(gè)無(wú)關(guān)個(gè)體擁有完全相同的 20個(gè)基因型的幾率極低,借此可用于個(gè)體識(shí)別。

SNPs應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別時(shí)必須擁有較高的 Het和較低的 Fst[2]。既往國(guó)內(nèi)外研究[4,8]或者未能同時(shí)獲得低 Fst和高 Het,或者未能完成全基因組篩選。該研究由于利用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行篩選,因而能夠克服全基因組 SNPs量大的困難,并保證候選SNPs的等位基因頻率在各人群中一致,接近 0.50/ 0.50,既獲得了極低的 Fst,又獲得了極高的 Het。如此大量的高 Het和低 Fst的通用 SNPs的發(fā)現(xiàn),為該課題組在世界范圍內(nèi)首次報(bào)道[9]。作者已將該1 439個(gè)通用 IISNPs及其Het和 Fst值全部公布在公共網(wǎng)頁(yè) http：//legal-Med.b log.sohu.com上,供免費(fèi)查詢(xún)和下載。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù),該技術(shù)對(duì) DNA的序列分析不需要進(jìn)行電泳,DNA片段不需要熒光標(biāo)記,PCR結(jié)束后轉(zhuǎn)入該測(cè)序儀即可讀出序列結(jié)果,其最大的特點(diǎn)是對(duì)短距離 (幾十個(gè) bp)測(cè)序具有非常精確和快速的優(yōu)勢(shì),適合于SNPs分型[5-7]。該研究應(yīng)用了這一精確方法,因而分型結(jié)果極為可靠。

作者對(duì) 2個(gè) IISNPs的檢測(cè)結(jié)果表明,在樣本量擴(kuò)大 3倍以上的情況下,等位基因頻率與 HapMap數(shù)據(jù)相比,波動(dòng)不大 (rs4607417在 HapMap 4個(gè)人群中的平均等位基因頻率為 0.467/0.533,rs749305 在 HapMap 4個(gè)人群中的平均等位基因頻率為0.489/0.511),說(shuō)明篩選所獲得的 1 439個(gè) IISNPs 是 HapMap樣品人群中通用的個(gè)體識(shí)別遺傳標(biāo)記。

該研究結(jié)果還顯示,所檢測(cè)的 2個(gè) IISNPs的 Het值高,DP值高,且 Fis絕對(duì)值較小,表明該次取樣穩(wěn)定。另外,作者發(fā)現(xiàn)僅在 rs4607417上其等位基因頻率與JPT人群有差異,證明了該2個(gè) IISNPs完全可用于個(gè)體識(shí)別,為其投入實(shí)際應(yīng)用提供了參考。

致謝 感謝基因科技(上海)有限公司舒暢在焦磷酸測(cè)序方面提供的協(xié)助。

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(2009-03-17收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Screening and genotyp ingof highly infor mative and universally app licable single nucleotide polymorphis Ms for individual identification

ZENG Zhaoshu1),WANG L i2),FANG Yu3),ZHANG Shuhong1),ZHANG Guangzheng1),1)1)D epartMen t of Lega l Med icine,College of Basic Med ica l Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou

ind ividual iden tification;single nuc leo tide po lymo rphis m;rs4607417;rs749305;pyrosequencing

A im：To genoMe-w idely search for high ly info r Mative single nucleotide po lymorphis Ms(SNPs)siMultaneously existing among the world’s Major populations and to lay a basis for SNPs’app lications on individual identification. Me thods：The genotyp ing data of 270 individuals(about 4 000 000 SNPs per genome)were down loaded froMthe HapMap database.A set of coMputer p rograMswas self-edited and perfo rMed to extract SNPsw ith Mino r allele frequency(MAF)≥0.45 among the four popu lations：U.S.residents w ith northern and w estern European ancestry by the Centre d’Etude du po lymorphis Me HuMain(CEPH orCEU),Han Chinese in Beijing(HCB),Japanese froMTokyo(JPT)and Yo ruba peop le of Ibadan,N igeria(YR I).Subsequently,a fo llow ing-on assess Menton two of the extracted SNPs,rs4607417 and rs749305, was carried outw ith increased samp le size(Han Chinese in Henan,n=144)by pyrosequencing techno logy to confirMwhether theywere as info rMative as their HapMap HCB reco rds(n=45)when samp le size becaMe larger.Resu lts：A totalof 1 439SNPswere found to be shared by the four populationsw ithMAF≥0.45.The genotyp ing of rs4607417 and rs749305 showed that their HW P were 0.872 and 0.423,their Het were 0.476 and 0.524,their PI C were 0.384 and 0.388,their DP were 0.616 and 0.612 among Han Chinese in Henan,respectively.No significant difference was found between our samp ling and the HapMap HCB reco rdson the allele frequenciesof the two tested SNPs excep t for rs4607417 in JPT population(χ2=5.068, P=0.024).Conc lus ion：Rs4607417 and rs749305 are highly infor Mative.These 1 439SNPs are highly reliable and credible for the development of a core identity-testing SNP panel among the world populations.

DF795.2

＊國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30700966;中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目 20070420812;鄭州大學(xué)引進(jìn)人才專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目 2005450001 2)D epartMen t of Parasito logy,Co llege of BasicMed ica l Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001 3)D epartMen t of EMergency Med icine,the First Affilia ted Hospita l,Zhengzhou University, Zhengzhou 450052