張愛玲,滕軍放,趙莘瑜

鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經內科鄭州 450052

#通訊作者,男,1960年11月生,本科,主任醫(yī)師,研究方向:腦血管病,E-mail:tjf.6666@yahoo.com.cn.

動脈粥樣硬化是缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)發(fā)生的重要病理生理基礎,研究[1-2]表明半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C)作為最主要的內源性組織蛋白酶抑制劑,與同型半胱氨酸(Hcy)、半胱氨酸蛋白酶等相互作用,參與動脈粥樣硬化及心腦血管疾病的病理生理過程, cystatin C編碼基因CST3及Hcy代謝酶蛋氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase,MTRR)基因發(fā)生變異可能導致表型變化而影響體內cystatin C及Hcy水平[3-5],從而可能改變ICVD的易感性,目前國內外報道較少且不一。作者采用病例-對照研究探討CST3基因G73A及MTRR基因A66G多態(tài)性與ICVD的關系,進一步探索ICVD的易感基因。

1 對象與方法

1.1 對象 病例組為隨機選取 2008年 10月至2009年 5月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經內科住院的ICVD患者,均符合中華醫(yī)學會第4屆全國腦血管學術會議制定的診斷標準,并經頭顱 CT和(或)MRI檢查確診,共187例,其中男122例,女 65例,年齡(67.2±13.1)歲。對照組為性別、年齡與病例組相匹配的同期健康體檢的隨機個體及同期住院的非ICVD病例共122例,其中男79例,女43例,年齡(65.7±10.5)歲。2組均為為河南漢族人,相互無血緣關系;病例組排除外心源性腦栓塞,低血容量所致的腦梗死、無癥狀性腦梗死,且除外嚴重肝腎疾病、癲癇及惡性腫瘤等。

1.2 臨床資料及標本收集 由 2名經過培訓的神經內科醫(yī)師嚴格篩查入組人員,并詳細記錄臨床一般資料及各種危險因素。抽取禁食 12 h后清晨空腹外周靜脈血4mL置于EDTA抗凝管中,儲存于-40℃冰箱集中提取DNA。

1.3 M TRR和CST3基因PCR擴增與限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析 用人全血基因組提取試劑盒(德國BMS公司)提取DNA,PCR引物由北京三博遠志生物技術有限公司合成,PCR MigicMix購自北京天恩澤基因科技有限公司,限制性內切酶NdeⅠ和SacⅡ購自MBI Fermentas公司。①MTRR基因A 66G上游引物:5′-CAGGCAAAGGCCATCG CAGAAGACAT-3′;下游引物:5′-CACTTCCCAAC CAAAATTCTTCAAAG-3′。PCR擴增體系30μL,其中DNA模板2μL,上、下游引物各2μL,PCRMigic-Mix 15μL,滅菌雙蒸水9μL。PCR反應條件:94℃預變性4 min,94℃60 s、58℃60 s、72℃60 s,共35個循環(huán),末次循環(huán)后72℃延伸 5m in,25 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒別PCR產物。NdeⅠ37℃酶切PCR產物過夜,酶切產物用 35 g/L瓊脂糖凝膠電泳,紫外線凝膠電泳成像儀內判斷基因型并攝像。②CST3基因G73A上游引物:5′-GGTCCTCTC TATCTAGCTCC-3′;下游引物:5′-CTCCTGGAAGCT GATCTTAG-3′。PCR擴增體系同上。PCR反應條件:95℃預變性5 min,95℃45 s、58.6℃45 s、72℃45 s,共32個循環(huán),末次循環(huán)后72℃延伸7 min, 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒別PCR產物。SacⅡ37℃酶切PCR產物過夜,酶切產物用25 g/L瓊脂糖凝膠電泳判斷基因型。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0進行分析,組間基因型及等位基因頻率分布分析采用 χ2檢驗,用優(yōu)勢比(odds ratio,OR)及95%可信區(qū)間(CI)估計基因突變對疾病發(fā)生的相對風險,Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 M TRR基因PCR擴增結果及RFLP分析結果 MTRR擴增產物片段長度為151 bp(圖1)。擴增產物酶切后可產生3種基因型:野生AA型產生124及27 bp片段,突變雜合子 AG型為 124、151和27 bp片段,突變純合子GG型為151 bp片段(圖 2)。由于27 bp片段相對分子質量小,泳動速率快,瓊脂糖凝膠電泳顯示不出。

2.2 病例組和對照組MTRR A 66G基因型及等位基因頻率比較 對照組MTRR A66G基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=3.357,P=0.067);其中GG型在病例組的分布頻率35.3%高于對照組的23.0%(χ2=5.314,P=0.021),GG基因型的優(yōu)勢比OR為1.831(95%CI:1.091～3.073);病例組G等位基因的優(yōu)勢比OR為1.505(95%CI:1.086～2.087),見表1。

表1 MTRR A 66G基因型和等位基因頻率分布 例(%)

2.3 CST3基因PCR擴增結果及RFLP分析結果CST3擴增產物片段長度為557 bp(圖3)。擴增產物酶切后可產生3種基因型:野生GG型產生422及135 bp片段,突變雜合子GA型為557、422和135 bp片段,突變純合子AA型為557 bp片段(圖4)。

2.4 病例組和對照組CST3G 73A基因型及等位基因頻率比較 對照組CST3 G73A基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.969,P=0.374),2組CST3G73A基因型及等位基因頻率比較見表2。

表2 CST 3G73A基因型及等位基因頻率分布 n(%)

3 討論

高Hcy血癥是缺血性腦血管病的獨立危險因素,其對內皮細胞功能的影響是引發(fā)動脈粥樣硬化病變的關鍵。最近研究[6]表明cystatin C參與細胞外基質降解與血管壁重構、影響粒細胞的吞噬與趨化功能,從而促進粥樣硬化斑塊中炎癥的發(fā)生與發(fā)展[1],其相關基因多態(tài)性與心腦血管疾病的關系近年來備受人們關注。

Hcy代謝酶MTRR基因定位于5p15.2-15.3,該基因包含15個外顯子,其常見的多態(tài)性位點 A66G (rs1801394),為蛋氨酸被異亮氨酸替代,導致該酶表達與功能上的改變而影響體內 Hcy水平。Gueant-Rodriguez等[5]研究認為AA基因型與高Hcy血癥及冠心病有關。Naushad等[7]則認為MTRR GG型是南印度人深靜脈血栓形成的危險因素,G等位基因與血漿Hcy水平呈正相關。而Bosco等[8]認為MTRR A66G基因多態(tài)性與ICVD沒有關系。作者的研究結果顯示MTRR A66G基因型及等位基因頻率在ICVD病例組和對照組中的分布差異均有統(tǒng)計學意義,提示 MTRR基因多態(tài)性與河南漢族人ICVD的易感性有關,GG型在病例組的分布頻率(35.3%)顯著高于對照組(23.0%)。說明GG基因型是ICVD的易感基因型,這與國外研究結果不一致,可能為不同種族、地域的遺傳背景不同和環(huán)境差異所造成遺傳表型不同。

Cystatin C主要功能是抑制內源性半胱氨酸蛋白酶的活性,2者在體內的表達失衡可能導致了動脈血管壁胞外基質的損傷,是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個重要因素[9]。cystatin C的編碼基因CST3位于染色體20p11.2,全長 7 292 bp,包括 3個外顯子,CST3多態(tài)性已成為近年來研究的熱點。Eriksson等[10]研究了CST3基因7個多態(tài)性位點與冠心病的關系,發(fā)現(xiàn)CST3啟動子2個(-82G/C和-78T/G)突變單倍體人群與cystatin C的低水平表達明顯相關,同時發(fā)現(xiàn)這 2個突變單倍體人群冠狀動脈狹窄數(shù)目明顯增高,表明CST3基因多態(tài)性與冠心病相關。作者發(fā)現(xiàn)河南漢族人群 CST3基因G73A位點存在多態(tài)性,但與ICVD發(fā)病無關,可能不是其的遺傳影響因素。

綜上所述,MTRR基因A66G多態(tài)性可能與ICVD相關,而CST3基因G73A多態(tài)性可能與其無關,但ICVD是由多個易感基因的微小表型效應累積到一定程度,再加上環(huán)境因素共同作用的結果,且基因多態(tài)性很大程度上受到種族、地域不同的影響,因此有待進一步擴大樣本進行多民族地域間的研究來探討ICVD的易感基因,為其防治提供科學依據。

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