李 楊,孫 莉,李曉文#,陳 輝

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科鄭州 450052

#通訊作者,女,1955年生,本科,教授,研究方向:遺傳病分子機(jī)制與基因診斷,E-mail:lixaowen@zzu.edu.cn

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)的重復(fù)單位長2～6 bp,STR在整個(gè)人類基因組中分布廣泛,目前是法醫(yī)DNA分析中最常用的一類遺傳標(biāo)記[1]。在日常檢案中,除常見的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體和二聯(lián)體鑒定外,有時(shí)因父母已故或因某種原因不能參與鑒定,當(dāng)事人便會(huì)要求進(jìn)行同胞兄弟間的血緣鑒定。作者將7個(gè)Y染色體STR(Y-STR)位點(diǎn)(DYS19、DYS385、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、A7.1和H4)和13個(gè)常用的常染色體STR位點(diǎn)(CSFIPO、TPOX、THOI、F13AOI、VWA、D16S539、D7S820、D13S317、 D18S51、D3S1358、D21S11、D8S1179和D5S818)聯(lián)合運(yùn)用于同胞兄弟鑒定,探討其可行性以指導(dǎo)實(shí)踐。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 隨機(jī)抽取來自河南漢族不同家系的80對同胞(包括 34對兄弟)和 80對無關(guān)個(gè)體(包括51對男性無關(guān)個(gè)體)的外周血樣各2mL,EDTA抗凝,-20℃保存。

1.2 DNA提取 常規(guī)苯酚-氯仿抽提法提取DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物分離 所有檢材(即80對同胞和80對無關(guān)個(gè)體)均擴(kuò)增13個(gè)常染色體STR基因位點(diǎn)。34對兄弟和 51對男性無關(guān)個(gè)體擴(kuò)增 7個(gè)Y-STR基因位點(diǎn)。常染色體復(fù)合位點(diǎn)擴(kuò)增反應(yīng)體系見表1,擴(kuò)增條件:96℃預(yù)變性2min;94℃1 min, 60℃1min,70℃1.5min,共10個(gè)循環(huán);以后90℃1 min,60℃1min,70℃1.5 min,共20個(gè)循環(huán);最后60℃延伸30min,4℃保存。Y-STR位點(diǎn)擴(kuò)增反應(yīng)體系見表 2、表 3。DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ和DYS390擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3min;94℃15 s,58℃20 s,72℃20 s,共5個(gè)循環(huán);94℃15 s,54℃20 s,72℃20 s,共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。A7.1和H4擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃45 s,61℃45 s,72℃45 s,共30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min,4℃保存。DYS385擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃30 s,59℃30 s,72℃1 min,共2個(gè)循環(huán);94℃30 s,57℃30 s,72℃1min,共2個(gè)循環(huán); 94℃30 s,56℃30 s,72℃1min,共29個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。DYS19擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性12min;94℃1min,60℃1m in,72℃1min (每個(gè)循環(huán)退火溫度依次降低0.5℃);94℃1min, 56℃1min,72℃1min,共30個(gè)循環(huán);72℃終延伸10min,4℃保存。Y-STR引物序列從STRBase(http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase)查找,常染色體STR位點(diǎn)引物均來自基因組數(shù)據(jù)庫。擴(kuò)增產(chǎn)物用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,銀染顯示電泳結(jié)果,根據(jù)等位基因梯階對照命名等位基因。

表1 常染色體STR復(fù)合擴(kuò)增體系

表2 DYS390、DYS389Ⅰ/Ⅱ和A 7.1、H 4復(fù)合擴(kuò)增體系

1.4 觀測指標(biāo) 計(jì)算7個(gè)Y-STR位點(diǎn)的單倍型多樣性;用ITO法計(jì)算13個(gè)常染色體STR位點(diǎn)的同胞組和無關(guān)個(gè)體組的同胞關(guān)系指數(shù)(PIFS)[2],并按公式W=PI/(PI+1)分別計(jì)算同胞關(guān)系概率(WFS),式中 W為父權(quán)概率,PI為親權(quán)指數(shù)[2-3];分析每對同胞在7個(gè)Y-STR位點(diǎn)和在常染色體STR位點(diǎn)等位基因的匹配情況。

表3 DYS19、DYS385復(fù)合擴(kuò)增體系

1.5 同胞關(guān)系判斷方法 以同胞組與無關(guān)個(gè)體組全相同基因數(shù)或全不同基因數(shù)無重疊為標(biāo)準(zhǔn),即全相同數(shù)≥5或全不同數(shù)≤1提示為同胞關(guān)系,全不同數(shù)≥6或全相同數(shù)≤0提示為無關(guān)個(gè)體。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0對常染色體STR位點(diǎn)等位基因匹配結(jié)果行兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Y-STR位點(diǎn)的單倍型分析 34對兄弟的7個(gè)Y-STR基因位點(diǎn)均相同,51對無關(guān)男性個(gè)體中 2、3、4、5和 6個(gè)基因位點(diǎn)不同的個(gè)體對數(shù)分別為 2、5、13、14和 14例,7個(gè)基因位點(diǎn)全不同者 3例,7個(gè) YSTR位點(diǎn)的單倍型多樣性為0.999 233。同胞組中A6/B6與 A7/B7的單倍型完全一致,均為 11/12-13/12/29/23/11/11(表 4);非同胞組中單倍型 12/ 12-17/13/30/24/11/12出現(xiàn) 3次,單倍型 11/13-18/ 11/27/24/10/11出現(xiàn) 2次。

2.2 13個(gè)常染色體STR位點(diǎn)基因匹配結(jié)果 同胞組中13個(gè)常染色體STR位點(diǎn)PIFS值為0.049 6-1.667×108,WFS值為96.064%;無關(guān)個(gè)體組中13個(gè)常染色體STR位點(diǎn)PIFS值為6.143×10-6-3.535, WFS值為 3.544%。80對同胞與 80對無關(guān)個(gè)體 13個(gè)常染色體位點(diǎn)等位基因匹配結(jié)果見表 5。

2.3 同胞關(guān)系判斷結(jié)果 以13個(gè)常用的常染色體STR位點(diǎn)檢測 51對男性無關(guān)個(gè)體和 34對兄弟,同胞兄弟中有5對不能判斷,分別為 A11/B11、A25/B25 (全相同基因數(shù)為 3,全不同基因數(shù)為 3),A20/B20、A30/B30(全相同基因數(shù)為 4,全不同基因數(shù)為 2), A24/B24(全相同基因數(shù)為 3,全不同基因數(shù)為 2)。在無關(guān)個(gè)體組中 15例不能判斷,分別為全相同基因數(shù)為 1,全不同基因數(shù)為 4的 3例;全相同基因數(shù)為3,全不同基因數(shù)為 5的 3例;全相同基因數(shù)為2,全不同基因數(shù)為 4的 2例;全相同基因數(shù)為 3,全不同基因數(shù)為 3的2例;全相同基因數(shù)為 4,全不同基因數(shù)為3的 2例;全相同基因數(shù)為 2,全不同基因數(shù)為 5的 1例;全相同基因數(shù)為1,全不同基因數(shù)為3的1例;全相同基因數(shù)為 1,全不同基因數(shù)為 5的 1例。聯(lián)合運(yùn)用這 20個(gè)位點(diǎn)僅有 5對同胞不能確定。

表4 同胞兄弟7個(gè)Y-STR位點(diǎn)單倍型分析結(jié)果(n=80)

表5 13個(gè)常染色體STR位點(diǎn)等位基因匹配結(jié)果(n=80) 例

3 討論

Y染色體序列結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,除擬常染色質(zhì)區(qū)外,大部分在減數(shù)分裂中不出現(xiàn)重組交換,因此以單倍型概率計(jì)算。作者選取了 7個(gè)常用的分布于擬常染色質(zhì)區(qū)外的Y-STR位點(diǎn),分析其在男性同胞鑒定中的應(yīng)用價(jià)值。研究結(jié)果顯示,7個(gè)Y-STR位點(diǎn)單倍型多樣性為0.999 233。但值得注意的是,來自不同家系的同胞對(A6/B6與A7/B7)之間及無關(guān)個(gè)體之間都有相同單倍型出現(xiàn),說明無血緣個(gè)體的7個(gè)Y-STR單倍型也可能完全相同。Y-STR位點(diǎn)是全男性遺傳,較常染色體STR位點(diǎn)應(yīng)用方便,但多態(tài)性普遍不太理想,一般在4～6個(gè)等位基因,因此,用較少的Y-STR位點(diǎn)進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定有誤判的可能。僅用常染色體STR鑒定同胞兄弟需要檢測大量位點(diǎn),作者以 13個(gè)常染色體STR位點(diǎn)檢測34對同胞和51對無關(guān)個(gè)體,同胞組與無關(guān)個(gè)體組仍分別有 5對和 15對不能判斷。聯(lián)合運(yùn)用這 20個(gè)位點(diǎn)僅有 5對同胞不能確定。

綜上所述,當(dāng)僅用常染色體或Y-STR位點(diǎn)鑒定同胞兄弟時(shí),均有誤判可能,如果將7個(gè)Y-STR位點(diǎn)和13個(gè)常染色體STR位點(diǎn)聯(lián)合運(yùn)用來鑒定同胞兄弟,則可大大增加判斷率。該研究中 Y單倍型相同的無關(guān)個(gè)體之間及來自不同家系的同胞對(A6/ B6與A7/B7)之間,13個(gè)常染色體STR位點(diǎn)全不同位點(diǎn)數(shù)均≥6,或全相同數(shù)≤0,可以認(rèn)定為無關(guān)個(gè)體。而13個(gè)常染色體STR位點(diǎn)不能判斷的 5對同胞的7個(gè)Y-STR位點(diǎn)單倍體相同,提示可能具有同胞關(guān)系,但須增加檢測的基因數(shù)目,從而進(jìn)行確定; 15對無關(guān)個(gè)體中,7個(gè)Y-STR位點(diǎn)中不同基因位點(diǎn)數(shù)均≥2,可以確定為無關(guān)個(gè)體。

同時(shí)檢測Y-STR和常染色體STR可有效提高鑒定率,效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于僅用其中之一,而且省時(shí)省力,應(yīng)用方便。在實(shí)際工作中應(yīng)采用多少個(gè)基因位點(diǎn)可達(dá)到最佳效果,有待于進(jìn)一步探討。

[1]陸惠玲,劉秋玲,臺(tái)云春,等.常染色體STR遺傳標(biāo)記在同胞鑒定中的應(yīng)用[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2003,18(3): 154

[2]陸惠玲,楊慶恩.用 ITO法計(jì)算兩個(gè)體間的血緣關(guān)系機(jī)會(huì)[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2002,17(3):188

[3]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京:中國人民公安大學(xué)出版社,2002:102