何長倫 王壽明 鄭紀山 張益紅 唐雨德

HBV是一種具有包膜的雙鏈DNA病毒，一般認為其非直接致細胞病變，HBV感染引發(fā)的急、慢性肝炎是人體免疫系統(tǒng)在清除HBV感染的過程中對肝細胞破壞的表現(xiàn)[1]。在免疫系統(tǒng)清除肝細胞中HBV時起核心作用的是HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL，即為活化的CD8+T細胞）。在對慢性HBV感染者的一些研究中，由于樣本量和研究方法的不同，研究者發(fā)現(xiàn)HBV特異性CTL在抗病毒方面的作用的結(jié)果不盡相同[1～3]，表明慢性乙型肝炎免疫發(fā)病機理的復(fù)雜性。由于HBV宿主范圍窄，難以建立合適的HBV感染動物模型，體外建立HBV抗原特異性CTL克隆成為研究病毒與宿主免疫反應(yīng)的重要方法之一。我們采用HLA-A限制性表位肽刺激和有限稀釋法，建立了慢性乙型肝炎患者外周血特異性T細胞克隆，并對所獲得的細胞克隆的特性進行了分析。

材料與方法

一、病人 男性慢性乙型肝炎患者，40歲。診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會和肝病學(xué)分會2000年聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》。血清 HBsAg、抗-HBe、抗-HBc陽性以及HBV DNA陽性，抗-HAV-IgM、抗-HCV、抗-HEV以及抗-HIV均為陰性。未進行抗病毒治療。

二、主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），HLA-A位點高分辨分型試劑盒（PEL-FREEZ公司），絲裂霉素C（MMC，Sigma公司），重組人白介素-2（rhIL-2，R＆D公司），重組乙型肝炎核心抗原（rHBcAg，Prospec公司），乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒檢測試劑盒（Promega公司），流式細胞儀（FACS Calibur，美國BD公司），鼠抗人CD8-PE和CD3-FITC（深圳晶美生物公司），鼠抗人CD4-FITC、抗IFN-γ-FITC/抗IL-4-FITC 單克隆抗體（Mabtech公司）。

三、人白細胞相關(guān)抗原A位點（HLA-A）高分辨檢測 采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCRSSP）分型技術(shù)。簡要步驟如下：取EDTA抗凝血2ml，過柱吸附法提取DNA，PCR擴增。擴增產(chǎn)物電泳后在紫外透射儀下觀察結(jié)果并照相。應(yīng)用PEL-FREEZ SSP分析軟件判斷結(jié)果。

四、抗原肽合成 經(jīng)上述方法測得該例患者的HLA-A等位基因為2402/—。選擇并合成HBV核心（HBc）117-125[4]作為 HLA-A*2402 限制的 CTL 表位肽，長度為9個氨基酸，序列為EYLVSFGVW，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。經(jīng)高壓液相色譜儀純化后凍干，純度＞98%。凍干肽以20mg/ml二甲亞砜溶解，再以1mg/ml用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

五、外周血單個核細胞（PBMC）的制備 取肝素抗凝外周靜脈血4ml，加等量無血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋混勻，用人淋巴細胞分離液2000rpm/min離心20min，收集PBMC層。用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌、離心3次，作細胞計數(shù)。

六、飼養(yǎng)細胞的制備 自體或異體PBMC用于制備飼養(yǎng)細胞。異體PBMC來自志愿者，未感染過乙型肝炎病毒，為HAL-A*24。調(diào)整細胞數(shù)至1×106/ml，按25μg/ml加 MMC，37℃水浴 40min，使細胞失去增殖能力，用無鈣、鎂Hanks液洗滌2次，去除MMC，備用。

七、抗原肽和rHBcAg刺激PBMC培養(yǎng) 取PBMC 2×106/ml懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)液（含2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，0.1mM HEPES，10%AB型熱滅活人血清）中，加入抗原肽10μg/ml、rHBcAg 1μg/ml。加于 24 孔培養(yǎng)板，1ml/孔。實驗第3天和第10天補加1ml完全培養(yǎng)液，并加入rhIL-2（終濃度10U/ml）；第7天換部分液體并加抗原肽、rhIL-2和自體飼養(yǎng)細胞（2×106/孔）。第21天測細胞毒活性并進行克隆化。

八、HBcAg特異性T細胞克隆的建立 采用有限稀釋法，在96孔培養(yǎng)板上分別按1、3個細胞/孔添加上述激活細胞，同時加入抗原肽（1μg/ml）、rhIL-2（100∪/ml）、PHA（1μg/ml） 和異體飼養(yǎng)細胞（2×105/孔）。間隔7天重復(fù)加刺激物和飼養(yǎng)細胞。根據(jù)克隆細胞生長情況擴大培養(yǎng)，每3天換部分液體，每10天重復(fù)刺激1次。根據(jù)需要進行亞克隆。對照孔只加異體飼養(yǎng)細胞、rhIL-2和PHA。

九、細胞毒試驗

（1）靶細胞：采用經(jīng)EBV誘導(dǎo)建立的自體B淋巴母細胞系（B-LCL）（建系方法見文獻[5]）2×106/ml，與合成的抗原肽10μg混合過夜，洗去游離抗原肽后，即為靶細胞；（2）細胞毒檢測：采用LDH釋放試驗，加靶細胞5000/管，效應(yīng)細胞與靶細胞各50μl混合，低速離心后，在5%CO237℃孵育4h，取上清 50μl加LDH基質(zhì)液50μl，室溫避光育30min，加中止液，在酶標儀測490nm 透光值（A）；（3）計算公式：細胞毒活性（%）=（實驗孔A值-效應(yīng)細胞自發(fā)釋放孔A值-靶細胞自發(fā)釋放孔A值）/（靶細胞最大釋放孔A值-靶細胞自發(fā)釋放孔A）×100%

十、流式細胞儀分析

（1）細胞表面標記：克隆細胞經(jīng)PBS洗滌1次，分別與鼠抗人CD3-FITC/CD8-PE/CD4-FITC單克隆抗體室溫避光孵育30min，洗去游離抗體，經(jīng)流式細胞儀分析10000個細胞，分析克隆細胞的表面標記；（2）細胞內(nèi)細胞因子：培養(yǎng)細胞按2μg/ml加入rHBcAg，于 37℃ 5%CO2培養(yǎng) 1h，再按 10μg/1ml加入 BFA，繼續(xù)培養(yǎng)5h，收集細胞，洗滌后經(jīng)固定、破膜，并分別與FITC標記的抗IFN-γ/IL-4室溫避光放置30min，洗去游離抗體后，加2%多聚甲醛500μl，經(jīng)流式細胞儀分析10000個細胞，分析克隆細胞的細胞內(nèi)細胞因子。為避免飼養(yǎng)細胞產(chǎn)生細胞因子的影響，在最后一次添加飼養(yǎng)細胞后至少15天再進行檢測，并以單獨培養(yǎng)的飼養(yǎng)細胞和未染色的克隆細胞作本底對照。

結(jié)果

一、HLA-A基因分型結(jié)果 應(yīng)用PCR-SSP分型技術(shù)，該例慢性乙型肝炎患者的HLA-A等位基因組合為2402/—（圖1）。根據(jù)文獻報道[4]，選擇相應(yīng)的CTL優(yōu)勢表位肽—HBc117-125作為乙型肝炎特異性T細胞株的抗原刺激物，長度為9個氨基酸，序列為EYLVSFGVW。

圖1 慢性乙型肝炎患者HLA-A*2402/—

二、HBc表位特異性CTL的誘生 新鮮分離的PBMC經(jīng)rHBcAg及抗原肽刺激3周后，測得的細胞毒活性為43.7%，提示PBMC中的表位特異性CD8+被激活。

三、T細胞克隆的建立及細胞表面標記分析 將抗原肽激活的PBMC通過有限稀釋法進行克隆化，獲得了11個細胞克?。▓D2），克隆形成率為11.4%（11/96），以飼養(yǎng)細胞作對照的20個孔中無細胞生長。經(jīng)熒光抗體染色和流式細胞儀分析，在11個克隆細胞株中9株為CD3+/CD4-/CD8+T細胞株，CD3表達率為90.2%～97.6%，CD8表達率為87.3%～92.2%，CD4表達率為1.4%～4.6%；另2株為CD3+/CD4+/CD8-T細胞株。

圖2 生長14天的細胞克隆

四、細胞內(nèi)細胞因子情況 在9株CD8+T細胞克隆株中有2株僅表達IFN-γ（Tc1），4株表達IFN-γ和IL-4（Tc0），3 株僅表達 IL-4（Tc2）。2 株 CD4+T 細胞克隆均同時表達IFN-γ和IL-4（Th0）。

五、CD8+T細胞克隆的特異性細胞毒活性 分別采用效靶比例為 1：1，2.5：1 和 5：1，結(jié)果見圖 3。

圖3 CD8+T細胞克隆的特異性細胞毒活性

討論

在急性HBV感染者能檢出對HBV多種抗原強烈的特異性CTL反應(yīng)，其特異性細胞毒反應(yīng)可達40%～80%，而在慢性乙型肝炎則不然，特異性細胞毒反應(yīng)往往低于20%[6]。但在某些能夠自然清除HBeAg或/和HBsAg的慢性感染者以及慢性乙型肝炎急性發(fā)作或稱為肝炎突發(fā)（hepatitis flares）狀態(tài)的患者，其HBV特異性CTL的數(shù)量增多，特異性細胞毒反應(yīng)也有升高[6，7]。本文在1例慢性乙型肝炎突發(fā)患者[8]，就診時ALT達正常10倍以上，入院后病情趨于好轉(zhuǎn)，ALT下降，但始終未達正常，HBV DNA表現(xiàn)為低水平復(fù)制（2×105copies/ml），HBsAg陽性，HBeAg陰性。取患者急性發(fā)作期的PBMC在經(jīng)表位肽刺激后，對結(jié)合有表位肽的靶細胞的細胞毒活性達到43.7%，與文獻報道相似[6]，提示特異性CTL活性增高與慢性乙型肝炎急性發(fā)作有關(guān)。

特異性CD8+T細胞的激活及其生物學(xué)效應(yīng)的產(chǎn)生受到HLA-I，特別是HLA-A的限制。在近年來發(fā)現(xiàn)的HBV特異性CTL識別的諸多表位中，絕大部分是HLA-A2限制的，對HLA-A2陽性HBV感染者特異性 CTL 的研究報道也較多[6，9，10]。HLA-A*2402 是我國常見的等位基因型之一，但關(guān)于該基因型的HBV特異性 CTL 的報道較少[2，3，11]。本實驗中 HBV 感染者為HLA-A*2402/-，所選刺激抗原必須是HLA-A*2402限制的CTL表位。中國人群流行的乙型肝炎基因型（B型和C型）與歐美流行株不同，故以國外文獻報道的HBV的CTL表位氨基酸序列作參照序列，國內(nèi)李曉東等[12]發(fā)現(xiàn) HBV特異性CTL表位氨基酸序列變異發(fā)生頻率較高，其中作為HLA-A*2402限制性表位的HBc23-31在B型和C型的變異發(fā)生率分別達到31%和16%，而HBc117-125則未見變異發(fā)生。據(jù)此，我們選擇了HBc117-125作為本實驗研究中的CTL激活抗原。實驗中HBc117-125能夠激活PBMC中的CTL，并在隨后的細胞毒試驗中得以證實，該結(jié)果進一步表明HBc117-125是HLA-A*2402限制的CTL特異性優(yōu)勢表位。

有限稀釋法常被用于CTL前體細胞或記憶細胞的頻數(shù)分析（有限稀釋分析，LDA）[13]，也用于目標細胞的克隆化[14]，雖然操作繁瑣，耗時長，卻能有效地獲得高純度的目標細胞群。我們應(yīng)用該法獲得11株能持續(xù)培養(yǎng)的T細胞克隆，克隆率為11.4%。在9株CD8+T克隆均具有細胞毒活性，其中2個Tc1型克隆細胞株的細胞毒活性（85.4%，90.2%，效靶比例為2.5：1）高于Tc0/Tc2株（39.1%～60.4%）。該結(jié)果是Tc亞型的特點還是僅為所建克隆株的特點，由于細胞株較少，有待在今后的研究中進一步觀察。

與有些報道采用HLA-I部分匹配的異體B-LCL作靶細胞不同[6]，本實驗采用自體B-LCL作靶細胞，因此是HLA-I完全匹配的。在實驗中我們也曾采用異體B-LCL作靶細胞，HLA-A基因組合為2403/2409，細胞溶破率低于用自體B-LCL作靶細胞的結(jié)果，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（資料未列出）。

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