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        單用A23187誘導(dǎo)外周血單個核細胞成樹突狀細胞及其介導(dǎo)耐藥腫瘤細胞殺傷的實驗研究

        2010-03-08 03:02:26王寶中王麗萍王彥文張麗華孫桂明
        當(dāng)代醫(yī)學(xué) 2010年10期
        關(guān)鍵詞:耐藥實驗

        王寶中 王麗萍 王彥文 張麗華 孫桂明

        1 材料與方法

        1.1 材料來源

        MCF-7/ADM(耐阿霉素乳腺癌細胞系)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所惠贈。A23187為SIGMA公司產(chǎn)品;rhGM-CSF為廈門特寶公司產(chǎn)品;rhIL-4、rhTNF-a為STRATHMANN BIOTECH GMBH產(chǎn)品;RPMI1640干粉(美國GIBCOBRL);MTT試劑、二甲基亞砜(DMSO)均購自SIGMA公司。

        1.2 實驗方法和步驟

        1.2.1 鈣離子載體(A23187)誘導(dǎo)單核細胞

        1.2.2 聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)單核細胞

        1.2.3 收獲樹突狀細胞的鑒定

        1.2.3.1 形態(tài)學(xué) 細胞形態(tài)學(xué)分析,倒置顯微鏡下觀察細胞并攝影。

        1.2.3.2 免疫表型 用于細胞表面標(biāo)志檢測的單克隆抗體分別為PE結(jié)合的鼠抗人CD1a、HLA-DR、CD83、CD80單抗及CD86單抗。

        1.2.3.3 DCs激活T淋巴細胞

        DC誘導(dǎo)特異性CTL的產(chǎn)生:參考文獻[4]T淋巴細胞與負載特異性抗原DC按1:100效靶比混合培養(yǎng)72小時,收集細胞即為CTL。

        1.2.3.4 MTT殺傷試驗

        參照文獻[4]并略作改動。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

        2 結(jié)果

        2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)單個核細胞形態(tài)學(xué)變化的特點

        培養(yǎng)24小時后,光鏡下見CK組誘導(dǎo)細胞體積增大并增殖,而A23187組除上述改變外,少數(shù)細胞已可見2~3個刺狀突起。48小時后兩組均見明顯多形性,CK組部分細胞也可見少許突起。培養(yǎng)3天后,具有刺狀突起的細胞數(shù)量增多,且突起更為明顯,培養(yǎng)至7天時,多數(shù)細胞呈典型的DC形態(tài)。見圖1、2。

        2.2 不同誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)DC速度的比較

        不同時間各組細胞因子對K562-DC的誘導(dǎo)率見表1。結(jié)果表明A23187組誘導(dǎo)率在3天,7天時均明顯高于CK組(P均<0.05),且A23187組3天時的誘導(dǎo)率已明顯高于CK組7天時的誘導(dǎo)率(P均<0.01)。

        2.3 誘生DCs介導(dǎo)CTL對耐藥細胞的殺傷效應(yīng)

        誘生DC介導(dǎo)的CTL(DC活化CTL的比例為1:100)對靶細胞殺傷率(MCF-7/ADM)的比較見表2。從表中數(shù)值各組DC均能激活異基因淋巴細胞并介導(dǎo)其對MCF-7/ADM細胞殺傷,且隨效靶比的增高,殺傷率也升高;且兩組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        3 討論

        本課題通過聯(lián)用GM-CSF、IL-4和TNF-α與A23187成功的誘導(dǎo)外周血單個核細胞成DC,并通過對二者的比較發(fā)現(xiàn)鈣離子載體能更快速有效地誘導(dǎo)出功能活性的樹突狀細胞。在應(yīng)用180~275ng低濃度的A23187時,PBMC能在24小時左右即可有部分細胞呈現(xiàn)出DCs的形態(tài),72小時誘導(dǎo)率達60%左右,明顯高于聯(lián)用細胞因子組;且培養(yǎng)3天后各種表面標(biāo)志的表達均與細胞因子培養(yǎng)7天組相同。這均提示與聯(lián)合細胞因子組相比,A23187能更快速有效地將PBMC細胞誘導(dǎo)成為DCs。為了進一步證明此種方法誘導(dǎo)DC的可靠性,我們又從表型及功能方面進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)A23187誘生的DCs具有較細胞因子組相似或更強的刺激異基因淋巴細胞增殖的能力,而且證實該種來源的DC介導(dǎo)了CTL對耐藥腫瘤細胞較強的殺傷作用。

        表1 不同時間各組細胞因子DC的誘導(dǎo)率比較()

        表1 不同時間各組細胞因子DC的誘導(dǎo)率比較()

        注:實驗重復(fù)3次。

        組別誘導(dǎo)率3d 7d A23187組 58.8±18.6 24.5±15.1 CK組 66.5±11.4 48.5±15.3

        表2 不同因子誘生DC介導(dǎo)的CTL對靶細胞的殺傷效應(yīng)()

        表2 不同因子誘生DC介導(dǎo)的CTL對靶細胞的殺傷效應(yīng)()

        注:實驗重復(fù)3次。

        組別 效靶比10:1 20:1 40:1 80:1 A23187-DC 12.75±2.87 21.25±9.64 32.44±10.27 43.78±12.19 CK-DC 9.59±8.47 24.04±3.43 28.82±13.78 48.25±15.56

        圖1 A23187誘導(dǎo)的PBMCDC(×400倍)

        圖2 聯(lián)合CK誘導(dǎo)的PBMCDC(×400倍)

        [1]Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immuneogenicity[J].Annu Rev Immunol,1991,9:271-296.

        [2]St.Louis DC,Woodcock JB,Fransozo G,et al.Evidence for distinct intracellular signling pathways in CD34(+)progenitor to dendritic cell differentiation from a human cell model[J].J Immun,1999,162:3237-3248.

        [3]孟冬梅,趙春亭,吳少玲,等.急性髓細胞白血病細胞來源的樹突細胞的誘導(dǎo)及功能研究[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2004,12:625-631.

        [4]趙春亭,王寶中,孟冬梅,等.單用A23187快速誘導(dǎo)K562細胞分化成樹突細胞的研究[J].中華血液學(xué)雜志,2005,26:408-412.

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