李盛璞,師如意,王秋蘭,潘 潔,蔡繼業(yè)*,張守全

(1.暨南大學化學系,廣東廣州510632;2.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,廣東廣州510642)

精原干細胞(spermatogonial stem cells,SSC)是位于睪丸曲細精管基膜上的雄性生殖系干細胞,既具有干細胞的基本特征,即能進行自我增殖更新以維持自身群體恒定,又能定向分化產(chǎn)生各級生精細胞,直至精子,從而向子代傳遞遺傳信息。因此,SSC是人和動物體內(nèi)能將遺傳信息傳遞給后代惟一的成體干細胞[1-2]。SSC承載著向子代傳遞遺傳信息的能力,而細胞的表面微觀結(jié)構(gòu)和機械性能的變化和偏離都會影響SSC的生長、增殖、更新、分化等諸多方面的能力,進一步可能影響其在人體內(nèi)發(fā)揮的作用。將豬的SSC在體外進行分離培養(yǎng),并對其微觀形貌和力學性質(zhì)進行研究,有助于深入了解精子發(fā)生的調(diào)控機制,為探討干細胞結(jié)構(gòu)與體外培養(yǎng)[3]、自我增殖分化[4-5]、移植[6]等功能的關系奠定了基礎。

原子力顯微鏡(atom ic force microscope,AFM)是1986年由Binning G,Quate C F和Gerber C等發(fā)明的[7]。通過使用一根約幾微米長,針尖半徑小于10 nm的探針來對樣品的表面進行探測,通過探測針尖與樣品之間的相互作用力(主要是范德華力)的變化來獲得物體表面形貌結(jié)構(gòu)的信息,其橫向分辨率可達到0.5 nm以下,縱向分辨率可小于0.1 nm。由于此高分辨率的優(yōu)勢,AFM被廣泛用于獲取導體、半導體、非導體等表面微觀信息。在生物醫(yī)學方面,AFM比起其他顯微鏡,如:普通光學顯微鏡、透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡(TEM、SEM)、激光共聚焦顯微鏡(LSM)等更體現(xiàn)了無法比擬的優(yōu)勢,其樣品制備簡單,損傷小;能進行三維立體觀察;并進一步獲取表面形貌和機械性能等定量數(shù)據(jù)[8-10]。本研究嘗試使用AFM在單細胞水平上[11-12]研究從睪丸中分離純化出來的SSC,重點是從納米尺度上獲取SSC的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)[13]及表面膜的機械性能,為SSC膜表面定性、半定量、定量的研究提供了可視化證據(jù)。AFM是在微觀領域?qū)SC基礎研究的有效工具,其對SSC的探測結(jié)果在干細胞以及生殖方面的研究起到一定的提示作用。

1 材料與方法

1.1 材料

2.5 g/L胰蛋白酶、1.5mg/mL膠原蛋白酶Ⅳ、100單位/mL雙抗為Sigma公司產(chǎn)品,100 mL/L胎牛血清(FCS)為H yclone公司產(chǎn)品,DM EM/F12為Gibco BRL公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離純化及培養(yǎng) 聯(lián)合使用胰蛋白酶與膠原蛋白酶對幼年豬的睪丸進行消化處理30 min,所得的細胞懸液用差速貼壁方法進行分離,每次為8 h～10 h,重復3次。所得純化后的SSC在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2、100%濕度條件下進行培養(yǎng),以備下一步試驗用。

1.2.2 樣品制備 取SSC,滴在玻片上,自然鋪展后吸附10 m in,先用pH 7.4的PBS緩沖液沖洗1次,然后用40 g/L的多聚甲醛固定15 min,再用蒸餾水沖洗3次,室溫自然干燥。使用40 g/L的多聚甲醛固定SSC對其形貌和表面機械性質(zhì)均影響較小。

1.2.3 AFM成像 將制備好的樣品固定在AFM(Autoprobe CP Research,veeco公司,USA)的XY掃描臺上,用監(jiān)視器定位所要掃描的樣品區(qū)域,在空氣中室溫下利用接觸模式成像。試驗中采用100μm掃描器,UL20B硅探針,力常數(shù)為2.8 N/m,AFM圖像僅經(jīng)自帶軟件IP2.1(Thermomicroscopes proscan image processing software version 2.1)平滑處理,以消除掃描方向上的低頻背景噪音。利用AFM力位移曲線測量系統(tǒng)在同一加載速率下測量得到力的曲線進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 精原干細胞分離培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)過雙酶對幼年豬的睪丸進行消化處理30min后,測得消化液中細胞活率為92.41%±3.41%。消化液中細胞大部分為貼壁的睪丸支持細胞(STO),其余的是一些懸浮細胞,如:SSC、淋巴細胞、紅細胞等[13-14]。差速貼壁法純化后可明顯分出STO與其他細胞,STO是一種貼壁生長的細胞,在整個溶液中測得細胞貼壁率為60.38%±6.45%。經(jīng)過多次差速貼壁純化后,懸液中的細胞幾乎為SSC,還有極少量的淋巴細胞、紅細胞和未貼壁的STO。SSC為成體干細胞,經(jīng)由堿性磷酸酶染色鑒定(AP%)為91.61%±4.04%。將純化后的SSC在、7℃,體積分數(shù)為5%的CO2、100%濕度條件下進行培養(yǎng)1周左右,仍保持細胞活性。

2.2 倒置顯微鏡分析

采用倒置顯微鏡對SSC分離純化的過程進行觀察,酶對睪丸消化處理后所得的溶液中,包含了幾種不同細胞(圖1A)。消化液中大部分為STO(圖1C、圖1E),貼壁細胞STO經(jīng)過差速貼壁法處理后,吸附在培養(yǎng)瓶底部,呈不規(guī)則的長梭形。其他細胞如SSC、淋巴細胞、紅細胞等均為懸浮細胞,存在于消化液中。經(jīng)過多次差速貼壁后,溶液中基本不含有STO,大多數(shù)為SSC(圖1B)。用堿性磷酸酶與OCT4免疫熒光標記染色(圖1D、圖1F),證明直徑約在10μm～20μm之間的細胞確實為所需的SSC。通過倒置顯微鏡可明顯看出SSC的形態(tài),多呈圓形或輕微橢圓形,體積大、胞質(zhì)較少、核大,明顯區(qū)別于STO不規(guī)則的長梭形和紅細胞呈現(xiàn)的圓盤狀,雖然淋巴細胞大多也呈現(xiàn)圓形,但直徑約為5μm左右,比SSC小1倍～2倍。通過倒置顯微鏡等儀器能宏觀了解和區(qū)分SSC,但無法獲得細胞表面的微觀信息,因此再用AFM分析SSC結(jié)構(gòu)和機械性質(zhì),微觀與宏觀相結(jié)合,進一步探測研究SSC的諸多性質(zhì)。

圖1 差速貼壁法分離豬的精原干細胞及鑒定Fig.1 Identification of porcine SSCs isolated by differential adhesion method

2.3 AFM對精原干細胞外形分析

運用AFM對30個細胞掃描統(tǒng)計,SSC直徑為10μm～20μm(圖2A),細胞高度分布在1.8μm～2.5μm之間(圖2C)。細胞為較為光滑的圓球,表面不均勻分布著一些顆粒物質(zhì)(圖2B、圖2D)。進一步獲取更精確的掃描圖,對SSC細胞膜進行5μm、1μm的超微結(jié)構(gòu)分析,由誤差信號圖2D和光學圖2F可知細胞表面局部較光滑,不像間充質(zhì)干細胞那樣粗糙,但仍存在一些大小不一的顆粒物質(zhì)。膜表面顆粒分布圖2G顯示SSC表面顆粒大小為700 nm～900 nm。可能為膜表面的蛋白質(zhì)、脂、糖等聚集物。選取多個不同細胞1μm×1μm膜表面超微結(jié)構(gòu)圖的整個區(qū)域,利用IP2.1分析軟件對其進行測量,得到超微結(jié)構(gòu)參數(shù)值:高低差(Rp-v)為(142.36±21.98)nm、均方根粗糙度(Rq)為(38.29±7.41)nm、平均粗糙度(Ra)為(31.13±7.51)nm、平均高度Meant H t為(118.77±11.05)nm。這些數(shù)據(jù)從普通光學顯微鏡無法得到。

2.4 AFM對精原干細胞機械性能分析

細胞膜表面的機械性能的變化用肉眼無法看見,但機械性能的改變影響著整個細胞的各種能力,所以在了解細胞結(jié)構(gòu)信息之后有必要對力學性質(zhì)進一步分析。AFM微懸臂自由端的探針接近、壓入樣品表面,然后脫離樣品,此過程AFM測量并記錄針尖的受力,從而得到力曲線(圖3A)。AFM在細胞膜表面獲得的每條力曲線都是系統(tǒng)自動測量15次得到的平均值。本試驗測量30個細胞,每個細胞測量5個不同區(qū)域并進行統(tǒng)計,測量區(qū)域為2μm×2μm。細胞膜的機械性質(zhì)主要是細胞的黏彈力、硬度、楊氏模量等。在相同的加載速率下,SSC與AFM針尖相互作用得到細胞表面力曲線的數(shù)據(jù),統(tǒng)計具有代表性的100條,通過SPSS13.0統(tǒng)計分析,SSC機械性質(zhì)均符合高斯分布(圖3B、圖3C、圖3D)。黏彈力集中在47.31 pN±19.75 pN。硬度也是表征細胞膜表面力學性質(zhì)的一個重要參數(shù),胞膜表面的硬度為力曲線中退針時的斜率,即細胞的黏彈力與距離的比值,從而得到細胞表面的硬度為2.23mN/m±0.66mN/m,細胞表面硬度由細胞的骨架決定,影響細胞的流動性。由赫茲模型(Hertzm odel)[14-15]公式F=4E(Rδ3)1/2/[3(1–ν2)],可知細胞膜表面的楊氏模量與細胞表面的黏彈力有關,它反映膜表面的剛性。式中ν是泊松比,磷脂雙分子層和細胞的ν=0.5;R是探針的半徑,R＜10 nm;δ是壓痕深度,為細胞膜厚度的1/10;E是楊氏模量,F是黏彈力。由公式算得楊氏模量為3.48 kPa±1.45 kPa。因此由所知機械性能數(shù)據(jù)就能從微觀角度解釋SSC的一些行為。

圖2 精原干細胞(A～F)的AFM圖和膜表面顆粒分布圖(G)Fig.2 AFM images of SSC(A～F)and histog ram(G)

圖3 精原干細胞膜表面機械性能的AFM測量結(jié)果Fig.3 Histog rams for mechanical properties of SSC

3 討論

細胞生物學中,細胞的形貌和功能是緊密聯(lián)系在一起的,細胞表面的微小變化就可能引起細胞性質(zhì)和功能的差異。AFM是樣品表面信息的收集工具,較易獲得細胞的形貌、超微結(jié)構(gòu)及其表面機械性能等信息,是在微觀領域研究細胞的有力工具。本試驗利用AFM對豬的SSC表面形貌進行了單細胞成像,定量的獲得了細胞表面的超微結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(如膜表面平均粗糙度、表面顆粒大小等),同時對細胞膜表面的機械性質(zhì)(黏彈力、硬度、楊氏模量)進行了測定,得出了相應的客觀指標。納米級別的分析為SSC的功能的深入研究提供了基礎。整個試驗過程樣品處理簡單、對細胞的損傷小、成像直觀、分辨率高,獲得定量的數(shù)據(jù)等都展示了AFM具有其他細胞表面形貌觀察方法所無法比擬的優(yōu)越性。借助AFM對SSC在微觀領域的研究,為更好地理解干細胞的生理功能提供了可視化的依據(jù),并對生殖方面也有一定的參考價值。

[1] Goel S,Sugimoto M,Minam i N,et al.Iden tification,isolation,and in vitro culture of porcine gonocytes[J].Biology of Reproduction,2007,77(1):127-137.

[2] Wolf F,Becker A,Streck fuss-Bom eke K,et al.Characterization and maintenance of adult spermatogonial stem cell culture[J].Hum an Gene Therapy,2009,20(11):1406-1406.

[3] 唐 紅,石國慶,管 峰,等.精原干細胞體外培養(yǎng)研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2008,29(6):87-89.

[4] Sadri-A rdekani H,Mizrak SC,van Daalen SK M,et al.Propagation of human spermatogonial stem cells in vitro[J].J the Am M ed Asso,2009,302(19):2127-2134.

[5] W u Z,Luby-Phelps K,Bugde A,et al.Capacity for stochastic self-renewal and differen tiation in mammalian spermatogonial stem cells[J].JCell Biol,2009,187(4):513-524.

[6] 曹效彰,岳順利,周佳勃.動物精原干細胞移植研究概況[J].動物醫(yī)學進展,2007,28(4):81-84.

[7] Binnig G,Rohrer H.Scanning tunnelingm icroscopy-from birth to adolescence[J].Phys Rev Lett,1986,56(9):930-933.

[8] Hu M Q,Wang JK,Zhao H X,et al.Nanostru cture and nanomechanics analysis of lymphocyte using AFM:From resting,activated to apoptosis[J].J Biomechanics,2009,42(10):1513-1519.

[9] Hu M Q,Wang J K,Cai J Y,et al.Nanostructu re and force spectroscopy analysisof human peripheral blood CD4+T cells using atomic force microscopy[J].Biochem Biophy Res Comm,2008,374(1):90-94.

[10] Addae-M ensah K A,Wikswo JP.Measu rement techniques for cellular biomechanics in vitro[J].Exp Biol Med,2008,233(7):792-809.

[11] 袁悼斌,趙 紅.單個細胞分析方法的研究現(xiàn)狀與展望[J].自然雜志,1999,22(6):315-320.

[12] Dvorak JA.The application of atomic force microscopy to the study of living vertebrate cells in culture[J].Methods,2003,29(1):86-96.

[13] Chen Y,Cai J Y,X ing S J,et al.Observation of ultrastructures of membrane surface of various tumor cells and preliminary research on the effect of drugs on membrane surface of tumor cells by AFM[J].JChin Electr Micros Soc,2003,22(2):100-104.

[14] Dimitriadis E K,Horkay F,Maresca J,et al.Determ ination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic for cemicroscope[J].Biophy J,2002,82(5):2798-2810.

[15] Brochu H,Vermette P.Young＇s moduli of surface-bound liposomes by atomic force microscopy force measurements[J].Langmuir,2008,24(5):2009-2014.