宋翥遠(yuǎn),卿上田,肖朝庭,黎滿香*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙410128;2.湖南省獸醫(yī)總站,湖南長沙410007)

雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的雞的一種急性高度接觸性呼吸道傳染病[1],主要以張口呼吸、咳嗽、氣管啰音、腺胃腫大、出血、“花斑腎”為主要特征。自1931年Schalk A F等[2]首次報(bào)道了經(jīng)典的呼吸型禽傳染性支氣管炎(IB)并確定為病毒性疾病以來,已有腸型、腺胃型、腎型等多種病型相繼報(bào)道。IBV與大多數(shù)RNA病毒一樣,在宿主細(xì)胞漿內(nèi)增殖,在病毒基因RNA轉(zhuǎn)錄過程中,形成5種較短的信使RNA(由大到小分別命名為mRNA6、5、4、3、2),其中mRNA2、mRNA3、mRNA4、mRNA6分別編碼IBV的4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白S(Spike,S)、E(Envelope,E)、M(Membrane,M)、N(Nucleocapsid,N)。按照蛋白的排列順序,依次對其進(jìn)行概述。

1 S蛋白

S蛋白是一個(gè)高度糖基化的糖蛋白,有21～28個(gè)N連接的糖基化位點(diǎn)[3]。它包括4個(gè)結(jié)構(gòu)域,即信號肽序列、外功能區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)[4]。S蛋白被酶解為氨基端S1和羧基端S2兩亞基,其中S1由約535個(gè)氨基酸組成(約90 ku),包含S蛋白的受體結(jié)合活性區(qū)域,缺失S1蛋白的IBV不能誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒中和和血凝抑制抗體,S1與病毒的組織嗜性有關(guān);S2由約627氨基酸組成(約84 ku),包含S蛋白的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),與S1非共價(jià)結(jié)合[5]。S蛋白上有重要的病毒抗原決定簇,基因突變會影響病毒的致病性[6]。報(bào)道稱在S蛋白的羧基端含有一由雙堿性氨基酸(-KKXX-COOH)組成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(retrieval signal,ER),具有把新合成的S蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基中間體上的作用[7]。但Youn S等[3]則通過構(gòu)建缺失S蛋白胞質(zhì)尾區(qū)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號和雙酪氨酸內(nèi)吞作用信號(endocytosis signal)的IBV,感染性克隆發(fā)現(xiàn)內(nèi)吞作用信號時(shí)病毒有效感染所必需的,但缺失內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號的病毒則具有活力。而S1亞基中294氨基酸Q突變?yōu)長導(dǎo)致S蛋白成熟和加工受阻,且S蛋白不能融合到病毒粒子中去。Xiao H等[8]采用雙酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀和免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)SARS-COV和IBV的S蛋白N端與真核起動子3相互作用,通過它影響宿主細(xì)胞基因,尤其是與病毒感染周期中相關(guān)基因的表達(dá)。通過熒光染色等檢測方法,證明在胞質(zhì)尾區(qū)中的酪氨酸1143是S蛋白的重要組成部分[9]。大量的研究認(rèn)為,IBV的變異部位主要在S1基因區(qū)。Kusters J G等[10]比較了4個(gè)不同血清型的IBV毒株的S1基因氨基酸序列后發(fā)現(xiàn),在545個(gè)S1氨基酸殘基中,只有243個(gè)是保守的,尤其是在50位～170位和50位～310位的氨基酸殘基發(fā)生替代的機(jī)率較大,而且120位～170位氨基酸殘基的插入或缺失的現(xiàn)象更是常見,其中的兩個(gè)高變區(qū)(hypervariable region,HVR),HVR1(56-59)和HVR2(117-133)和中和表位有關(guān)。Sapats S I等[11]比較了澳大利亞1962年—1991年間分離株的S1基因,發(fā)現(xiàn)S1基因長度發(fā)生了變化,發(fā)生插入或缺失主要位于59位～313位,而氨基酸差異主要位于53位～152位,192位～202位和288位～313位處。比較有毒力的嗜腎型Gray株與無毒力的JMK株發(fā)現(xiàn),氨基酸殘基123位～152位之間的變異可能是導(dǎo)致兩者致病性不同的關(guān)鍵。

2 E蛋白

該蛋白的大部分嵌入在囊膜中,由Mrna3的ORF3c編碼,分子質(zhì)量約為12.4 ku。在病毒粒子的組裝與出芽中具有重要作用,它的近氨基端具有錨定E蛋白的跨膜結(jié)構(gòu),胞質(zhì)尾區(qū)具有高爾基靶向信號,羧基端含有一個(gè)“RDKLYS”的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號,若把倒數(shù)第4位的賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０穭t導(dǎo)致E蛋白在高爾基體中大量積聚,另外,位于N端的第3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域在病毒的出芽中起著關(guān)鍵作用,敲除該區(qū)導(dǎo)致病毒組裝失敗,E蛋白胞質(zhì)尾區(qū)是與M蛋白相互作用的區(qū)域[12]。它使M蛋白與E蛋白定位在相同的細(xì)胞器而利于形成E和M蛋白復(fù)合體,因而使M蛋白組裝進(jìn)入病毒包膜中;如果這一區(qū)域缺失將導(dǎo)致病毒粒子復(fù)制大量減少[13]。但是Marta L D等在研究缺乏E蛋白的SARS重組病毒中發(fā)現(xiàn),E蛋白不是病毒復(fù)制必需的,不過它影響病毒生長,它的缺失使病毒的復(fù)制滴度較野生型感染性克隆低100倍以上[14]。說明E蛋白在不同的冠狀病毒之間存在功能差異。

3 M蛋白

M蛋白是由221個(gè)氨基酸組成的三次跨膜N糖蛋白,與S蛋白結(jié)合,被認(rèn)為是冠狀病毒組裝過程中的一個(gè)關(guān)鍵信號。它是病毒粒子的重要組成部分,并且在病毒的裝配、出芽和成熟過程中起到了重要的作用。M蛋白是IBV粒子中含量最高的糖蛋白,約占病毒總蛋白的40%,M蛋白聚集于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜中,與E蛋白、β-Actin相互作用,具有控制并介導(dǎo)病毒粒子從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或高爾基體膜出芽的作用,同時(shí),在病毒裝配時(shí)還與核衣殼蛋白(N)相互作用,并有將核衣殼蛋白結(jié)合到囊膜上的作用[15]。M蛋白的靶向信號位于它的第一個(gè)跨膜區(qū)而不同于E蛋白的胞質(zhì)尾區(qū),共表達(dá)M和E蛋白能夠形成病毒粒子[12]。M蛋白中A159和K160人工突變導(dǎo)致IBV的感染性喪失[15]。

4 N蛋白

N蛋白是冠狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,由377個(gè)至455個(gè)氨基酸組成,特征為具有高等電點(diǎn)、高絲氨酸含量,是一種多功能的磷酸化蛋白,在感染細(xì)胞中,是表達(dá)量最高的病毒蛋白之一。N蛋白在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起作用,而且具有很好的免疫原性,可在體內(nèi)產(chǎn)生高水平的抗體并介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞效應(yīng)[16]。N蛋白具有RNA結(jié)合位點(diǎn),參與病毒RNA的合成,含有核定位和核輸出信號調(diào)節(jié)胞質(zhì)與胞核動態(tài)運(yùn)輸過程。Spencer K A等[17]采用圓二色性和核磁共振的方法在研究IBV N蛋白和病毒RNA的關(guān)系中發(fā)現(xiàn),N蛋白和病毒RNA之間主要是靜電吸引作用,N蛋白氨基端與病毒RNA之間有大范圍的非特異相互作用,使得病毒RNA與N蛋白以一種“引誘-鎖定”的方式特異結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IBV N蛋白兩個(gè)保守磷酸化區(qū)域之中的近C端磷酸化區(qū)域與識別病毒RNA或非病毒RNA有關(guān),而且在IBV的拯救中,輔助表達(dá)磷酸化N蛋白的拯救成功率大大高于非磷酸化或半磷酸化N蛋白。N蛋白的磷酸化形式對IBV的生物學(xué)有著重要的作用[18]。在N蛋白的輸出機(jī)制方面,Reed M L等[19]研究了IBV感染的VeroV和DF-1細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在N蛋白羧基端的一個(gè)富含亮氨酸的八肽(291-LQLDGLHL-298)起著核輸出信號的作用,通過氨基酸替代和缺乏證實(shí)Leu296和Leu298是N蛋白從核中有效輸出所必需的,另采用來普霉素B阻斷發(fā)現(xiàn)該過程是一個(gè)不依賴可溶解性受體exportin 1的過程,不同于多數(shù)的核輸出信號所采用的機(jī)制。

5 結(jié)語

目前發(fā)現(xiàn),IBV至少有30種以上的血清型,不同的血清型或毒株之間交叉保護(hù)性弱,主要原因是由于IBV結(jié)構(gòu)性蛋白不穩(wěn)定造成的。以前傳染性支氣管炎病毒主要致力于S蛋白的研究,認(rèn)為S蛋白在進(jìn)化上比M蛋白、N蛋白、E蛋白都要活躍。但是近幾年來發(fā)現(xiàn),N蛋白在病毒進(jìn)化過程中也起到了至關(guān)重要的作用。綜上所述,通過IBV結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的研究,為研究傳染性支氣管炎的一些基本生命過程和規(guī)律提供新的思路,并對該病毒的防控具有重要意義,可為傳染性支氣管炎的預(yù)防與控制尋找新的途徑。

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