彭海龍,楊淑華,何劍斌

(沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧沈陽110161)

哺乳動物的精子發(fā)生過程是受到下丘腦-垂體-性腺軸所調控的,而且必須經過附睪的孵育才成為具有生殖功能的成熟精子。研究表明適宜的環(huán)境溫度對精子的發(fā)生是必需的[1]。由于溫室效應引起的全球氣候變暖的不斷加劇,近年來,很多地區(qū)相繼出現(xiàn)持續(xù)性高熱天氣,加之畜牧養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；⒓s化的發(fā)展,飼養(yǎng)密度相對過大,使飼養(yǎng)環(huán)境溫度升高。由環(huán)境高溫導致的動物熱應激給養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經濟損失[2]。人們也開始逐漸關注氣候變暖帶來的社會效應,其中之一就是熱應激對家畜生殖系統(tǒng)的影響和由此帶來的對家畜繁殖效率的影響,以及如何降低熱應激對家畜繁殖的影響。但目前對熱應激的發(fā)生機制尚不十分清楚,特別是熱應激對畜禽繁殖性能影響的機制,對雌性家畜研究的相對較多,而對雄性家畜的研究甚少,因此研究熱應激對雄性動物生殖機能的影響,對于預防和解決熱應激對動物繁殖性能的影響具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 選用3月齡,體重2 kg～2.5 kg,健康雄性新西蘭大白兔60只,隨機分為3組,分別為高熱應激組(39℃～41℃)、低熱應激組(32℃～34℃)和常溫對照組。每組20只,預飼1周后開始試驗。

1.1.2 試劑與儀器 南京建成生物有限公司的考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒。南京建成生物科技有限公司生產的過氧化氫酶(CAT)試劑盒。南京建成生物科技有限公司生產的超氧化物歧化酶(SOT)試劑盒。722型分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 熱應激處理 高熱應激組動物,每天11:30～14:30移入39℃～41℃的熱應激室內;低熱應激組動物,每天11:30～14:30移入32℃～34℃的熱應激室內;對照組常溫正常飼養(yǎng)。室內相對濕度56%～60%,連續(xù)應激60 d。

1.2.2 各項指標的測定 在試驗的第15、30、45、60天分別從各組取5只兔子心臟采血處死,立即取睪丸和附睪。取0.2 g～1.0 g組織,按1∶9比例加入8.6 g/kg的冷生理鹽水冰浴研磨,制取勻漿液。測定步驟和樣本處理均按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 用SPSS13.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行一般線性模型(GLM)分析;統(tǒng)計結果以平均數(shù)±標準差(_X±SD)表示。

2 結果

2.1 過氧化氫酶的活性

2.1.1 睪丸組織CAT的活性 如表1所示,隨著時間延長,睪丸組織CAT的活性呈增高趨勢。對照組在第15天時睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)第30天、45天和第60天;低熱應激組在第15天和第30天時睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)第45天和第60天;高熱應激組在第15天時睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)第30天、45天和第60天。

隨溫度升高,睪丸組織CAT的活性呈下降趨勢。第15天時高熱應激組睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)常溫對照組和低熱應激組;第30天時常溫對照組睪丸中CAT的活性顯著高于(P＜0.05)低熱應激組和高熱應激組;第45天時高熱應激組睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)常溫對照組和低熱應激組;第60天時高熱應激組睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)常溫對照組和低熱應激組。

表1 睪丸中過氧化氫酶(CAT)的活性Table 1 CA T activity in the testesU/mg

2.1.2 附睪組織CAT的活性 如表2所示,隨著時間延長,附睪組織CAT的活性呈增高趨勢。常溫對照組在第15天時附睪中CAT的活性顯著(P＜0.05)低于第30天、45天和第60天;低熱應激組在第60天時附睪中CAT的活性顯著(P＜0.05)高于第15天、30天和第45天;高熱應激組在整個試驗過程中差異不顯著。

隨溫度升高,附睪組織CAT的活性呈下降趨勢。在第15天和第30天時高熱應激組附睪中CAT的活性顯著(P＜0.05)低于其他兩組;第45天和第60天時,低熱應激組附睪中CAT的活性顯著(P＜0.05)低于常溫對照組,而高熱應激組附睪中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)低熱應激組。

表2 附睪中過氧化氫酶(CAT)的活性Table 2 CA T activity in the epididymisU/mg

2.2 超氧化物歧化酶的活力

2.2.1 睪丸組織SOD的活力 由表3所示,隨時間延長,睪丸組織SOD的活性呈降低趨勢。常溫對照組在45天和第60天時睪丸SOD的活力顯著低于(P＜0.05)第15天和第30天;低熱應激組在第15天時睪丸SOD的活力顯著高于(P＜0.05)第30、45、60天;高熱應激組在第60天時睪丸SOD的活力顯著低于(P＜0.05)第15天、30天和第45天。

隨溫度升高,睪丸組織SOD的活性呈下降趨勢。在第15天時高熱應激組睪丸中SOD的活力顯著低于(P＜0.05)常溫對照組和低熱應激組;在第30天時常溫對照組睪丸中SOD的活力顯著高于(P＜0.05)低熱應激組和高熱應激組;在第45天時高熱應激組睪丸中SOD的活力顯著低于(P＜0.05)常溫對照組和低熱應激組;第60天時對照組睪丸中SOD的活力顯著高于(P＜0.05)低熱應激組和高熱應激組。

表3 睪丸中超氧化物歧化酶(SOD)的活力Talbe 3 SOD activity in the testesU/mg

2.2.2 附睪組織SOD的活力 由表4所示,隨著時間延長,附睪組織SOD的活性呈降低趨勢。常溫對照組附睪中SOD的活力在整個試驗期無顯著變化;低熱應激組在第15天和第30天時附睪中SOD的活力顯著(P＜0.05)高于第45天和第60天;高熱應激組在第60天時附睪中SOD的活力顯著(P＜0.05)低于第15天、30天和第45天。

隨溫度升高,附睪組織SOD的活性呈下降趨勢。第15天、30天及45天時常溫對照組睪丸中SOD的活力均顯著高于(P＜0.05)低熱應激組和高熱應激組;第60天時常溫對照組睪丸中SOD的活力顯著高于(P＜0.05)低熱應激組;而低熱應激組睪丸中SOD的活力顯著高于(P＜0.05)高熱應激組。

表4 附睪中超氧化物歧化酶(SOD)的活力Table 4 SOD activity in the epididymisU/mg

3 討論

正常情況下,動物機體產生的自由基直接或間接發(fā)揮有益的生物學效應。在熱應激狀態(tài)下,動物機體產生過多的自由基而不能被及時清除,因而導致體內自由基過剩,從而引起脂質過氧化作用,破壞生物膜結構[3]。熱應激還會使線粒體中氧化與磷酸化的偶聯(lián)降低,造成電子泄漏和超氧化物基團增加,從而促進自由基生成[4-5]。

當動物機體受熱應激原作用時,體內兒茶酚胺類物質分泌增加,機體可能出現(xiàn)嚴重的組織缺血、缺氧。此外,熱應激狀態(tài)下,細胞能量分解大于合成,從而為氧自由基大量形成提供了條件,已有的研究表明,氧自由基在應激性疾病發(fā)生過程中起著重要作用[6]。

抗氧化酶系統(tǒng)是動物機體內重要的防御系統(tǒng),它與生殖細胞的分化和發(fā)育密切相關。組織中抗氧化酶水平過低時,活性氧水平相應升高,生殖細胞的結構受到損傷,最終使睪丸的生精功能受到損害及精子生成的質量與數(shù)量異常。目前抗氧化物酶對睪丸和附睪組織影響的有關報道有:用氧化應激誘導劑可使性成熟期的大鼠睪丸組織中SOD和CAT水平顯著下降,生精上皮退化,生殖細胞萎縮,生精小管管腔充滿壞死細胞,附睪中精子結構異常,數(shù)目下降,導致精子的生成障礙[7]?？寡趸高€可通過影響激素的水平間接影響精子的發(fā)生[8]。動物機體對熱應激有較強的自我調節(jié)能力,因為機體內部存在有效的清除自由基及抗氧化酶系統(tǒng),包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等[9]。SOD是動物機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶,對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用,在清除超氧陰離子自由基、抗氧化損傷、調節(jié)機體氧化還原狀態(tài)等方面都起重要作用,SOD活力的高低間接反映了動物機體清除自由基的能力。當機體受熱應激原作用時,體內兒茶酚胺類物質分泌增加,機體可能出現(xiàn)嚴重的組織缺血、缺氧,細胞能量分解大于合成,從而為氧自由基大量生成提供了條件。并且在缺血狀態(tài)下,血液和組織中的SOD活性下降,細胞清除氧自由基的能力降低,造成氧自由基堆積。氧自由基增多,使脂類形成脂質過氧化物,發(fā)生脂質過氧化作用。脂質過氧化作用是氧自由基對生物大分子的主要毒性作用。脂質過氧化作用一旦引發(fā)即可持續(xù)進行,呈鏈式反應,使自由基反應擴增放大。而脂質過氧化作用主要發(fā)生在生物膜和亞細胞器,致使脂質含量較高的機體細胞膜的結構發(fā)生變化,從而改變其對物質選擇性透過的能力。氧化脂質還可破壞維生素,使蛋白質、酶、激素以及核酸等變性失活,引起溶酶體顆粒崩潰,使一些酶漏出細胞,引起細胞破壞或死亡[10]。李權超等[11]研究表明,急性濕熱應激可引起體內組織SOD活性發(fā)生變化,表現(xiàn)為:隨應激時間延長而降低;隨應激強度的增高而降低;取消應激后逐漸恢復至正常水平。這些研究均表明,熱應激可導致自由基大量生成,導致細胞損傷,同時也證實了SOD等一些與自由基有關的生化指標的測定能準確地反映熱應激時自由基代謝變化的規(guī)律。

由上述報道可知,熱應激可導致機體產成大量自由基,從而損傷細胞。而抗氧化物酶是組成了機體抵抗自由基損傷的防御系統(tǒng),因此,測定抗氧化酶的活力能夠反映熱應激時自由基代謝變化的規(guī)律。我們采用比色法測定了熱應激后的兔子睪丸和附睪組織,上述兩種抗氧化物酶活性變化,觀察熱應激對種公兔生殖機能的影響,積累了一些有價值的科學資料。

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