彭海龍,楊淑華,何劍斌

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧沈陽110161)

哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生過程是受到下丘腦-垂體-性腺軸所調(diào)控的,而且必須經(jīng)過附睪的孵育才成為具有生殖功能的成熟精子。研究表明適宜的環(huán)境溫度對(duì)精子的發(fā)生是必需的[1]。由于溫室效應(yīng)引起的全球氣候變暖的不斷加劇,近年來,很多地區(qū)相繼出現(xiàn)持續(xù)性高熱天氣,加之畜牧養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；⒓s化的發(fā)展,飼養(yǎng)密度相對(duì)過大,使飼養(yǎng)環(huán)境溫度升高。由環(huán)境高溫導(dǎo)致的動(dòng)物熱應(yīng)激給養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。人們也開始逐漸關(guān)注氣候變暖帶來的社會(huì)效應(yīng),其中之一就是熱應(yīng)激對(duì)家畜生殖系統(tǒng)的影響和由此帶來的對(duì)家畜繁殖效率的影響,以及如何降低熱應(yīng)激對(duì)家畜繁殖的影響。但目前對(duì)熱應(yīng)激的發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚,特別是熱應(yīng)激對(duì)畜禽繁殖性能影響的機(jī)制,對(duì)雌性家畜研究的相對(duì)較多,而對(duì)雄性家畜的研究甚少,因此研究熱應(yīng)激對(duì)雄性動(dòng)物生殖機(jī)能的影響,對(duì)于預(yù)防和解決熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物繁殖性能的影響具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選用3月齡,體重2 kg～2.5 kg,健康雄性新西蘭大白兔60只,隨機(jī)分為3組,分別為高熱應(yīng)激組(39℃～41℃)、低熱應(yīng)激組(32℃～34℃)和常溫對(duì)照組。每組20只,預(yù)飼1周后開始試驗(yàn)。

1.1.2 試劑與儀器 南京建成生物有限公司的考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒。南京建成生物科技有限公司生產(chǎn)的過氧化氫酶(CAT)試劑盒。南京建成生物科技有限公司生產(chǎn)的超氧化物歧化酶(SOT)試劑盒。722型分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 熱應(yīng)激處理 高熱應(yīng)激組動(dòng)物,每天11:30～14:30移入39℃～41℃的熱應(yīng)激室內(nèi);低熱應(yīng)激組動(dòng)物,每天11:30～14:30移入32℃～34℃的熱應(yīng)激室內(nèi);對(duì)照組常溫正常飼養(yǎng)。室內(nèi)相對(duì)濕度56%～60%,連續(xù)應(yīng)激60 d。

1.2.2 各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定 在試驗(yàn)的第15、30、45、60天分別從各組取5只兔子心臟采血處死,立即取睪丸和附睪。取0.2 g～1.0 g組織,按1∶9比例加入8.6 g/kg的冷生理鹽水冰浴研磨,制取勻漿液。測(cè)定步驟和樣本處理均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 用SPSS13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一般線性模型(GLM)分析;統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(_X±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 過氧化氫酶的活性

2.1.1 睪丸組織CAT的活性 如表1所示,隨著時(shí)間延長(zhǎng),睪丸組織CAT的活性呈增高趨勢(shì)。對(duì)照組在第15天時(shí)睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)第30天、45天和第60天;低熱應(yīng)激組在第15天和第30天時(shí)睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)第45天和第60天;高熱應(yīng)激組在第15天時(shí)睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)第30天、45天和第60天。

隨溫度升高,睪丸組織CAT的活性呈下降趨勢(shì)。第15天時(shí)高熱應(yīng)激組睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)常溫對(duì)照組和低熱應(yīng)激組;第30天時(shí)常溫對(duì)照組睪丸中CAT的活性顯著高于(P＜0.05)低熱應(yīng)激組和高熱應(yīng)激組;第45天時(shí)高熱應(yīng)激組睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)常溫對(duì)照組和低熱應(yīng)激組;第60天時(shí)高熱應(yīng)激組睪丸中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)常溫對(duì)照組和低熱應(yīng)激組。

表1 睪丸中過氧化氫酶(CAT)的活性Table 1 CA T activity in the testesU/mg

2.1.2 附睪組織CAT的活性 如表2所示,隨著時(shí)間延長(zhǎng),附睪組織CAT的活性呈增高趨勢(shì)。常溫對(duì)照組在第15天時(shí)附睪中CAT的活性顯著(P＜0.05)低于第30天、45天和第60天;低熱應(yīng)激組在第60天時(shí)附睪中CAT的活性顯著(P＜0.05)高于第15天、30天和第45天;高熱應(yīng)激組在整個(gè)試驗(yàn)過程中差異不顯著。

隨溫度升高,附睪組織CAT的活性呈下降趨勢(shì)。在第15天和第30天時(shí)高熱應(yīng)激組附睪中CAT的活性顯著(P＜0.05)低于其他兩組;第45天和第60天時(shí),低熱應(yīng)激組附睪中CAT的活性顯著(P＜0.05)低于常溫對(duì)照組,而高熱應(yīng)激組附睪中CAT的活性顯著低于(P＜0.05)低熱應(yīng)激組。

表2 附睪中過氧化氫酶(CAT)的活性Table 2 CA T activity in the epididymisU/mg

2.2 超氧化物歧化酶的活力

2.2.1 睪丸組織SOD的活力 由表3所示,隨時(shí)間延長(zhǎng),睪丸組織SOD的活性呈降低趨勢(shì)。常溫對(duì)照組在45天和第60天時(shí)睪丸SOD的活力顯著低于(P＜0.05)第15天和第30天;低熱應(yīng)激組在第15天時(shí)睪丸SOD的活力顯著高于(P＜0.05)第30、45、60天;高熱應(yīng)激組在第60天時(shí)睪丸SOD的活力顯著低于(P＜0.05)第15天、30天和第45天。

隨溫度升高,睪丸組織SOD的活性呈下降趨勢(shì)。在第15天時(shí)高熱應(yīng)激組睪丸中SOD的活力顯著低于(P＜0.05)常溫對(duì)照組和低熱應(yīng)激組;在第30天時(shí)常溫對(duì)照組睪丸中SOD的活力顯著高于(P＜0.05)低熱應(yīng)激組和高熱應(yīng)激組;在第45天時(shí)高熱應(yīng)激組睪丸中SOD的活力顯著低于(P＜0.05)常溫對(duì)照組和低熱應(yīng)激組;第60天時(shí)對(duì)照組睪丸中SOD的活力顯著高于(P＜0.05)低熱應(yīng)激組和高熱應(yīng)激組。

表3 睪丸中超氧化物歧化酶(SOD)的活力Talbe 3 SOD activity in the testesU/mg

2.2.2 附睪組織SOD的活力 由表4所示,隨著時(shí)間延長(zhǎng),附睪組織SOD的活性呈降低趨勢(shì)。常溫對(duì)照組附睪中SOD的活力在整個(gè)試驗(yàn)期無顯著變化;低熱應(yīng)激組在第15天和第30天時(shí)附睪中SOD的活力顯著(P＜0.05)高于第45天和第60天;高熱應(yīng)激組在第60天時(shí)附睪中SOD的活力顯著(P＜0.05)低于第15天、30天和第45天。

隨溫度升高,附睪組織SOD的活性呈下降趨勢(shì)。第15天、30天及45天時(shí)常溫對(duì)照組睪丸中SOD的活力均顯著高于(P＜0.05)低熱應(yīng)激組和高熱應(yīng)激組;第60天時(shí)常溫對(duì)照組睪丸中SOD的活力顯著高于(P＜0.05)低熱應(yīng)激組;而低熱應(yīng)激組睪丸中SOD的活力顯著高于(P＜0.05)高熱應(yīng)激組。

表4 附睪中超氧化物歧化酶(SOD)的活力Table 4 SOD activity in the epididymisU/mg

3 討論

正常情況下,動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的自由基直接或間接發(fā)揮有益的生物學(xué)效應(yīng)。在熱應(yīng)激狀態(tài)下,動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生過多的自由基而不能被及時(shí)清除,因而導(dǎo)致體內(nèi)自由基過剩,從而引起脂質(zhì)過氧化作用,破壞生物膜結(jié)構(gòu)[3]。熱應(yīng)激還會(huì)使線粒體中氧化與磷酸化的偶聯(lián)降低,造成電子泄漏和超氧化物基團(tuán)增加,從而促進(jìn)自由基生成[4-5]。

當(dāng)動(dòng)物機(jī)體受熱應(yīng)激原作用時(shí),體內(nèi)兒茶酚胺類物質(zhì)分泌增加,機(jī)體可能出現(xiàn)嚴(yán)重的組織缺血、缺氧。此外,熱應(yīng)激狀態(tài)下,細(xì)胞能量分解大于合成,從而為氧自由基大量形成提供了條件,已有的研究表明,氧自由基在應(yīng)激性疾病發(fā)生過程中起著重要作用[6]。

抗氧化酶系統(tǒng)是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的防御系統(tǒng),它與生殖細(xì)胞的分化和發(fā)育密切相關(guān)。組織中抗氧化酶水平過低時(shí),活性氧水平相應(yīng)升高,生殖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受到損傷,最終使睪丸的生精功能受到損害及精子生成的質(zhì)量與數(shù)量異常。目前抗氧化物酶對(duì)睪丸和附睪組織影響的有關(guān)報(bào)道有:用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑可使性成熟期的大鼠睪丸組織中SOD和CAT水平顯著下降,生精上皮退化,生殖細(xì)胞萎縮,生精小管管腔充滿壞死細(xì)胞,附睪中精子結(jié)構(gòu)異常,數(shù)目下降,導(dǎo)致精子的生成障礙[7]。抗氧化酶還可通過影響激素的水平間接影響精子的發(fā)生[8]。動(dòng)物機(jī)體對(duì)熱應(yīng)激有較強(qiáng)的自我調(diào)節(jié)能力,因?yàn)闄C(jī)體內(nèi)部存在有效的清除自由基及抗氧化酶系統(tǒng),包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等[9]。SOD是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶,對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用,在清除超氧陰離子自由基、抗氧化損傷、調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原狀態(tài)等方面都起重要作用,SOD活力的高低間接反映了動(dòng)物機(jī)體清除自由基的能力。當(dāng)機(jī)體受熱應(yīng)激原作用時(shí),體內(nèi)兒茶酚胺類物質(zhì)分泌增加,機(jī)體可能出現(xiàn)嚴(yán)重的組織缺血、缺氧,細(xì)胞能量分解大于合成,從而為氧自由基大量生成提供了條件。并且在缺血狀態(tài)下,血液和組織中的SOD活性下降,細(xì)胞清除氧自由基的能力降低,造成氧自由基堆積。氧自由基增多,使脂類形成脂質(zhì)過氧化物,發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用。脂質(zhì)過氧化作用是氧自由基對(duì)生物大分子的主要毒性作用。脂質(zhì)過氧化作用一旦引發(fā)即可持續(xù)進(jìn)行,呈鏈?zhǔn)椒磻?yīng),使自由基反應(yīng)擴(kuò)增放大。而脂質(zhì)過氧化作用主要發(fā)生在生物膜和亞細(xì)胞器,致使脂質(zhì)含量較高的機(jī)體細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而改變其對(duì)物質(zhì)選擇性透過的能力。氧化脂質(zhì)還可破壞維生素,使蛋白質(zhì)、酶、激素以及核酸等變性失活,引起溶酶體顆粒崩潰,使一些酶漏出細(xì)胞,引起細(xì)胞破壞或死亡[10]。李權(quán)超等[11]研究表明,急性濕熱應(yīng)激可引起體內(nèi)組織SOD活性發(fā)生變化,表現(xiàn)為:隨應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)而降低;隨應(yīng)激強(qiáng)度的增高而降低;取消應(yīng)激后逐漸恢復(fù)至正常水平。這些研究均表明,熱應(yīng)激可導(dǎo)致自由基大量生成,導(dǎo)致細(xì)胞損傷,同時(shí)也證實(shí)了SOD等一些與自由基有關(guān)的生化指標(biāo)的測(cè)定能準(zhǔn)確地反映熱應(yīng)激時(shí)自由基代謝變化的規(guī)律。

由上述報(bào)道可知,熱應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)成大量自由基,從而損傷細(xì)胞。而抗氧化物酶是組成了機(jī)體抵抗自由基損傷的防御系統(tǒng),因此,測(cè)定抗氧化酶的活力能夠反映熱應(yīng)激時(shí)自由基代謝變化的規(guī)律。我們采用比色法測(cè)定了熱應(yīng)激后的兔子睪丸和附睪組織,上述兩種抗氧化物酶活性變化,觀察熱應(yīng)激對(duì)種公兔生殖機(jī)能的影響,積累了一些有價(jià)值的科學(xué)資料。

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