朱本清,楊小玉,顧 銳*,邱賓濤

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科,吉林 長(zhǎng)春 130033;2.北京蛋白質(zhì)組中心,北京 112206）

脊髓缺血再灌注損傷是脊柱外科臨床中較難預(yù)防的并發(fā)癥,產(chǎn)生災(zāi)難性的后果,目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制還很不明確,為全面系統(tǒng)研究損傷機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)觀察缺血、再灌注的蛋白表達(dá)規(guī)律,尋找差異蛋白。

1 材料與方法

1.1 儀器

IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT Twelve電泳系統(tǒng)、Typhoon 9410掃描儀、超聲破碎儀均是Amersham公司產(chǎn)品,美國(guó)ABI-4800型反射式基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜。

1.2 試劑

Cy2,Cy3,Cy5熒光染料是Amersham公司產(chǎn)品,DMF購(gòu)于SIGMA公司,裂解液（7M尿素、2M硫尿、4%CHAPS）、水化液（8M 尿素、2%CHAPS）、平衡母液（6M 尿素、50mM Tris-HCl、20%甘油、2%SDS）、RCDC定量試劑盒、10×電泳緩沖液（250 mM Tris、1.92M glycine、1%SDS）、Bradford 定量試劑盒 、30%丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=29∶1）、1.5 mol/L Tris-HCl（ph 8.8）、10%SDS均是Bio-Rad公司產(chǎn)品,低熔點(diǎn)瓊脂糖是BIOWEST公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備和脊髓標(biāo)本采集 清潔級(jí)兔由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。健康成年新西蘭大白兔,體重2.5-3.0 kg,雌雄不限。

動(dòng)物隨機(jī)分為:對(duì)照組（只行手術(shù)不阻斷腹主動(dòng)脈）、單純?nèi)毖M（缺血25min）、缺血（缺血25min）再灌組（6、12、24、48 h）,每組 6只。用 10%的水合氯醛按0.3mg/kg行腹腔注射麻醉,開(kāi)腹后于左腎動(dòng)脈分叉下用血管夾阻斷腹主動(dòng)脈造成脊髓腰骶段缺血。對(duì)照組和缺血組,于術(shù)后麻醉下取脊髓L4-5節(jié)段,缺血再灌注組缺血25m in后去除血管夾-—再灌注,關(guān)閉腹腔。再灌注6、12、24、48 h麻醉下活體取脊髓L4-5節(jié)段[1]。將所取材液氮速凍-70℃冰箱保存。

1.3.2 樣品制備 將組織用液氮預(yù)冷的砸碎器砸碎,將砸碎的粉末用液氮研磨,加Cocktail蛋白酶抑制劑20μl/m l,加入 lysis buffer,轉(zhuǎn)入Dounce勻漿器中勻漿。樣品放在裝有冰水混合物的燒杯里超聲,累計(jì)超聲60 s。再用純水超聲。室溫提取30 min,離心,4 0000 g*1 hrs4℃離心,小心取出上清,分別測(cè)量標(biāo)記出蛋白濃度,按照用途不同,分裝與保存在-80度冰箱。

1.3.3 蛋白標(biāo)記 調(diào)樣品終濃度為5mg/ml,pH在8.0-9.0之間,每個(gè)樣品取 50μg（10μl）混合成pool。取出DIGE染料母液,渦旋混勻30 s,12 000 g離心30 s,室溫放置 10 min,取0.4μl母液加入0.6 μl DMF混勻,分別加入50μg的pool和樣品中進(jìn)行標(biāo)記。12個(gè)樣品在膠中的分布及染料標(biāo)記;每塊膠中用不同染料標(biāo)記的pool和樣品混合,得到6管混合樣品,每管36μl加入等體積的2*sample buffer渦旋混勻每管中加入水化液至終體積450μl。

等電聚焦:取出IPG預(yù)制膠條,在聚焦盤(pán)中將上面6管混合樣品連續(xù)、線性加樣,去除IPG預(yù)制膠條的保護(hù)層。放入聚焦盤(pán),室溫放置30-60min。在膠條背面均勻、連續(xù)覆蓋礦物油。設(shè)置等點(diǎn)聚焦程序。

第二向SDS電泳:配置12%SDS凝膠,將IPG膠條取出,去油、吸干,然后放入平衡緩沖液Ⅰ、衡緩沖液Ⅱ后,取出IPG膠條,沖洗,吸干,放置在SDS凝膠的長(zhǎng)玻璃板上,封口后,迅速地將IPG膠條插入未凝固上的瓊脂糖封膠液中,凝固,放入SDS凝膠電泳槽中,開(kāi)始電泳,電泳結(jié)束后行熒光染色。

1.3.4 圖像掃描及分析 電泳結(jié)束后,用Typhoon 9410掃描儀在488/520 nm,532/580 nm,633/670 nm波長(zhǎng)分別對(duì)Cy2,Cy3,Cy5熒光染料標(biāo)記的圖像進(jìn)行掃描。用DeCyder v.5.02圖像分析軟件對(duì)DIGE圖像進(jìn)行分析和差異點(diǎn)尋找。觀察各個(gè)蛋白點(diǎn)在缺血和再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化,取正常組與缺血再灌注24 h組比較篩選差異點(diǎn)。

1.3.5 質(zhì)譜鑒定 應(yīng)用膠內(nèi)酶切法制備蛋白質(zhì)肽譜,應(yīng)用美國(guó)ABI-4800型反射式基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜反射式掃描,范圍:700-4000Da;激光能量:MS 5000,MSMS 5500應(yīng)用GPS軟件檢索在NCBI的兔形目數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,取誤差MS 0.2Da;MSMS 0.3Da;數(shù)據(jù)取舍標(biāo)準(zhǔn);取蛋白質(zhì)打分大于52分,置信水平95%以上[2]。

2 結(jié)果

對(duì)DIGE圖像進(jìn)行分析和差異點(diǎn)尋找。觀察各個(gè)蛋白點(diǎn)在缺血和再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化,發(fā)現(xiàn)在再灌注24 h點(diǎn)與其他時(shí)間點(diǎn)比有顯著變化,其他時(shí)間點(diǎn)間變化不顯著,共觀測(cè)出46個(gè)差異點(diǎn)。取正常組與缺血再灌注24 h組比較篩選差異點(diǎn),共鑒定出10個(gè)差異蛋白,見(jiàn)表1,圖1-4是典型蛋白在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化折線圖。

表1 差異蛋白

3 討論

蛋白質(zhì)組（proteome）是指一個(gè)基因組、一種生物、一種細(xì)胞或組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的開(kāi)展使對(duì)生命活動(dòng)的認(rèn)識(shí)由局限片面到具體系統(tǒng),由間接的基因水平深入到蛋白質(zhì)水平。雙向電泳（2-DE）是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù),是依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量的不同,通過(guò)兩次垂直方向的電泳,將復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上呈點(diǎn)狀分開(kāi)。該技術(shù)可用來(lái)建立細(xì)胞、組織或生物體基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的二維凝膠圖譜,即:蛋白質(zhì)組圖譜。2-DE技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)在于它可以對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)復(fù)雜的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行整體性分析,從而可以分析不同生理和病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)的表達(dá)變化,并從中總結(jié)出生命活動(dòng)的規(guī)律[3]。

圖1 alpha-tubulin的變化

圖2 succinate dehyd rogenase complex subunit A的變化

圖3 annexin VI的變化

圖4 neurofilament protein M的變化

脊髓缺血-再灌注損傷（Ischemia/Reperfusion I/R）的研究表明可能與微循環(huán)障礙、炎癥機(jī)制有關(guān),有細(xì)胞凋亡機(jī)制、水通道蛋白與脊髓損傷等學(xué)說(shuō),脊髓缺血再灌注損傷不同時(shí)限直接影響脊髓損傷修復(fù)與預(yù)后[4-6],然目前其確切損傷機(jī)制尚不清,缺乏有效的防治措施。根據(jù)近年來(lái)脊髓損傷機(jī)制研究新進(jìn)展,我們推測(cè)脊髓損傷后局部蛋白質(zhì)組表達(dá)將發(fā)生序貫性、特異性變化,運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),將系統(tǒng)闡述脊髓缺血再灌注損傷引發(fā)蛋白質(zhì)組變化特點(diǎn),篩查拮抗脊髓缺血再灌注損傷不同階段蛋白質(zhì)組作用水平調(diào)控點(diǎn),將獲得特異蛋白質(zhì)進(jìn)功能研究,明確其損傷機(jī)制,聯(lián)合生物學(xué)效應(yīng)分子水平作用靶點(diǎn),篩出具有臨床標(biāo)志意義、提供藥物作用的靶蛋白質(zhì)分子以及發(fā)現(xiàn)在信號(hào)傳遞中起重要作用的蛋白質(zhì)分子,將對(duì)于脊髓缺血再灌注損傷不同階段發(fā)生、發(fā)展、凋亡,針對(duì)新藥設(shè)計(jì)和調(diào)控脊髓缺血再灌序慣性損傷具有極其重要意義。

通過(guò)對(duì)損傷與正常脊髓蛋白質(zhì)組雙向熒光差異電泳（DIGE）圖譜以及兩者蛋白質(zhì)組匹配差異圖譜的分析發(fā)現(xiàn):損傷24小時(shí)蛋白變化最明顯,與正常脊髓蛋白質(zhì)組間存在46個(gè)差異點(diǎn),鑒定出10個(gè)差異蛋白。本次研究為探討脊髓缺血再灌注損傷機(jī)制打下了基礎(chǔ)。設(shè)想通過(guò)差異蛋白質(zhì)功能的研究,可以獲得脊髓損傷蛋白和保護(hù)蛋白,為今后的研究、診斷和治療,提供幫助。

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