張 鈺 李俊霞 顧 艷 李 奕

早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(ERSA)是指妊娠 12周以前,連續(xù)發(fā)生2次或 2次以上的自然流產(chǎn),臨床發(fā)病率 3%～5%。排除臨床上可查出的病因(染色體、解剖、內(nèi)分泌及感染因素),仍有近 1/2的ERSA患者病因未明,稱(chēng)不明原因早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(UERSA),是臨床上難治性的不育癥。隨著生殖免疫學(xué)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)UERSA因母胎免疫調(diào)節(jié)異常所致。最新的研究資料顯示,巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)在胚胎種植和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著極為重要的作用[1]。本文旨在探討 UERSA患者血清 MIF水平及MIF-mRNA在絨毛、蛻膜組織中的表達(dá)水平,試圖從母胎界面細(xì)胞免疫角度闡明 UERSA發(fā)病機(jī)制,為臨床建立有效的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和治療方案提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

1.UERSA組 知情同意下選取 2008年 1～12月在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院計(jì)劃生育門(mén)診因 UERSA就診的患者 30例。病例選擇條件：連續(xù)發(fā)生至少2次早期自然流產(chǎn),年齡 20～40歲,孕周為 7～12周,超聲檢查證實(shí)胚胎發(fā)育停止或枯萎孕卵、無(wú)原始胎心搏動(dòng);夫婦外周血染色體核型檢查正常;婦科檢查、超聲、子宮輸卵管造影排除生殖器官畸形;性激素、甲狀腺功能、血糖、胰島素等內(nèi)分泌檢查均正常;排除生殖道感染性疾病,如支原體、衣原體等感染;優(yōu)生 5項(xiàng)(TORCH)檢驗(yàn)均為陰性;自身抗體(抗心磷脂抗體)陰性,部分凝血活酶時(shí)間正常;男方精液常規(guī)檢查無(wú)異常。

2.正常早孕組 知情同意下選取自愿要求終止妊娠的健康早孕婦女 30例,年齡 20～40歲,孕周均在 7～12周,有 1次正常生育史,無(wú)自然流產(chǎn)或早產(chǎn)等不良孕產(chǎn)史。本次妊娠期間無(wú)陰道流血、腹痛等先兆流產(chǎn)癥狀和體征;超聲檢查證實(shí)胚胎發(fā)育正常,見(jiàn)胚芽和胎心搏動(dòng),接收當(dāng)日進(jìn)行吸宮手術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.血清MIF測(cè)定 兩組均在吸宮術(shù)前空腹抽肘靜脈血5ml加入促凝管中,上下混勻數(shù)次,室溫靜置 2h后,2 500r/m in離心 15min后,取上清液,置于 -80℃冰箱凍存待測(cè)。

2.絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA的表達(dá) 兩組均于吸宮術(shù)中取樣,于無(wú)菌條件下取絨毛、蛻膜組約 0.3g,立刻用DEPC水沖洗,迅速投入液氮,繼之保存于 -80℃低溫水箱中。RNAiso Plus抽取絨毛、蛻膜總RNA,cDNA合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)所用引物應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件 Gene runner自行設(shè)計(jì),由六合通生物技術(shù)有限公司合成。序列如下：β -actin：FW 5′-GCAAAGACCTGTACGCCAAC-3′,RV 5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′;MIF： FW 5′-CGCAGAACCGCTCCTACAG-3′,RV 5′-GCGTTCATGTCGTAATACTTGATG-3′。 總反應(yīng)體系 20μl。 實(shí)時(shí)定量 PCR用SDS211軟件進(jìn)行,選擇相對(duì)定量模式,每個(gè)標(biāo)本均作 2個(gè)重復(fù)孔。PCR循環(huán)條件：95℃預(yù)變性 10s,溫度變化速度為20℃/s;95℃ 5s、60℃(Cyclophilin 55℃)20s、 72℃10s,進(jìn)行 40個(gè)循環(huán),溫度變化速度為 20℃/s。在每個(gè)循環(huán)的延伸末檢測(cè)熒光信號(hào)。隨后是升溫程序：95℃ 0s,65℃ 15s,95℃ 0s,溫度變化速度為 0.1℃/s,繪制PCR產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)。PCR結(jié)束后,分析各孔CT值(模板擴(kuò)增到一定量拷貝數(shù)時(shí)即處于指數(shù)上升期所需反應(yīng)循環(huán)數(shù)大小)。根據(jù) 2-△△CT法,得出目的基因的量等于 2-△△CT的值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、血清MIF的水平

血清中 MIF濃度 UERSA組(10.98±3.02ng/m l)低于正常早孕組(16.53±4.34ng/ml),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

二、絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA的表達(dá)水平

UERSA組絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA的 2-△△CT值為0.022±0.001,0.97±0.58;正常早孕組絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA的 2-△△CT值為 1.29±1.11,1.20±0.85。 UERSA組患者絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA的表達(dá)均低于正常早孕婦女,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P＜0.05)。

三、血清MIF濃度與絨毛、蛻膜組織中 MIF-m RNA表達(dá)的相關(guān)性

UERSA組和正常早孕組血清中 MIF濃度與絨毛組織中MIF-mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.69,P＜0.05),與蛻膜組織中 MIF-mRNA的表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0.71,P＜0.05)。

討 論

一、MIF的來(lái)源和功能

1966年 Bloom和 David將由活化的 T淋巴細(xì)胞分泌的可抑制單核/巨噬細(xì)胞移動(dòng)的細(xì)胞因子正式命名為 MIF。近年來(lái),隨著體內(nèi) MIF蛋白分離、純化和MIF cDNA克隆的成功,人們對(duì)MIF的產(chǎn)生有了更深入的認(rèn)識(shí)?，F(xiàn)已證實(shí) MIF在腺垂體細(xì)胞、活化的T淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中高表達(dá)產(chǎn)生。巨噬細(xì)胞是 MIF的主要來(lái)源,MIF作用的靶細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫反應(yīng)中的重要角色,不僅參與非特異性免疫防御,而且是特異性免疫應(yīng)答中一類(lèi)關(guān)鍵細(xì)胞,它可以直接吞噬抗原異物,而且能呈遞抗原,分泌多種細(xì)胞因子和直接殺傷腫瘤細(xì)胞,廣泛參與免疫應(yīng)答、免疫效應(yīng)與免疫調(diào)節(jié),在許多疾病的病理變化中起關(guān)鍵作用。MIF具有多種生物活性,主要是抑制巨噬細(xì)胞游走,促進(jìn)其在炎癥局部浸潤(rùn)、增生,并促使巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子及化學(xué)物質(zhì)(如白介素 -1、腫瘤壞死因子 -a、一氧化氮),共同參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫[2]。

二、UERSA患者血清 MIF水平變化的意義

近年來(lái),隨著免疫學(xué)研究的深入,逐步認(rèn)識(shí)到 UERSA的發(fā)生與母胎界面局部細(xì)胞功能和細(xì)胞因子表達(dá)關(guān)系密切。目前,已知與妊娠相關(guān)的許多細(xì)胞因子的主要功能和作用機(jī)制,但針對(duì)MIF在正常妊娠和流產(chǎn)發(fā)生中的作用還鮮為報(bào)道。Arcuri等[3]報(bào)道,在子宮蛻膜的活性細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞中均有MIF的表達(dá),表明在胚胎植入期及發(fā)育期,該細(xì)胞因子扮演了重要角色。Yamada等[4]研究表明,一些胎兒染色體核型正常而反復(fù)流產(chǎn)的婦女,與有反復(fù)流產(chǎn)史但已有活產(chǎn)的婦女相比,早孕時(shí)期,前者血清中 MIF濃度有極顯著下降,與正常妊娠相比也有顯著差異,故推測(cè)她們?cè)缭衅陂g血清MIF濃度下降與流產(chǎn)相關(guān)。本研究也證實(shí),UERSA組血清中MIF濃度較正常早孕組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,由此推測(cè) MIF在妊娠的建立和維持中起著重要作用,是有助于建立早孕的因子,MIF的降低可能導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生,但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

三、絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA表達(dá)下降與 UERSA發(fā)生

母胎界面-蛻膜面富含母體來(lái)源且蛻膜浸潤(rùn)的免疫活性細(xì)胞和胎兒來(lái)源的滋養(yǎng)細(xì)胞,它們通過(guò)分泌細(xì)胞因子構(gòu)成復(fù)雜的細(xì)胞間信息網(wǎng)絡(luò),進(jìn)行母胎間的免疫對(duì)話(huà),形成有利于維持正常妊娠的免疫微環(huán)境。蛻膜免疫活性細(xì)胞主要由NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成。已有研究證實(shí),MIF可提高巨噬細(xì)胞在種植部位的濃度,激活巨噬細(xì)胞,增強(qiáng)其黏附力和吞噬作用,觸發(fā)吞噬活性破壞細(xì)菌,但不破壞胎盤(pán)細(xì)胞,保護(hù)胚胎免遭感染,激活的巨噬細(xì)胞在滋養(yǎng)細(xì)胞的誘導(dǎo)下還會(huì)分泌促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的細(xì)胞因子[5]。Ap te等[6]研究證實(shí)MIF屬于免疫抑制細(xì)胞因子,具有Th2型細(xì)胞因子的作用,MIF對(duì)胚胎植入時(shí)的細(xì)胞免疫有抑制作用,通過(guò)阻止自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)釋放細(xì)胞毒性穿孔顆粒而發(fā)揮其抑制NK細(xì)胞活性的作用,從而抑制活化的 NK細(xì)胞溶解滋養(yǎng)層細(xì)胞,使母體子宮接受胚胎。Bacher等[7]認(rèn)為母胎界面MIF還參與調(diào)節(jié)母體 T細(xì)胞激活和維持母胎界面 Th2型免疫,Th2型免疫偏移對(duì)正常妊娠胎盤(pán)的生長(zhǎng)是必要的,對(duì)胚胎植入和妊娠維持有重要意義[8]。最新研究還證實(shí),MIF除調(diào)節(jié)炎癥和免疫功能外,也促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)分化和新生血管的形成,對(duì)妊娠建立后滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖,胚胎的正常分化、發(fā)育和胎盤(pán)血管的生成可能有非常重要的作用[9]。

目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見(jiàn)關(guān)于 MIF在UERSA患者母胎界面的蛻膜、絨毛中表達(dá)水平的研究。本研究表明,UERSA患者母胎界面的蛻膜、絨毛中 MIF-mRNA的表達(dá)水平均較正常早孕婦女降低,表明這種異常,可能影響了滋養(yǎng)細(xì)胞與母體免疫細(xì)胞之間的免疫對(duì)話(huà),不利于母胎界面的免疫微環(huán)境發(fā)生正常妊娠的改變,導(dǎo)致母胎界面免疫耐受的格局被打破,最終導(dǎo)致了 UERSA的發(fā)生。

四、血清MIF水平和絨毛、蛻膜組織中 MIF-m RNA表達(dá)的相關(guān)性及意義

本研究顯示,UERSA組血清中MIF濃度較正常早孕組降低;血清MIF水平和絨毛、蛻膜組織中MIF-mRNA表達(dá)呈正相關(guān)性,表明妊娠期母體血清MIF主要來(lái)源于胎兒胎盤(pán)循環(huán),MIF的低血清濃度提示其可做為預(yù)測(cè) UERSA發(fā)生發(fā)展的有效監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

總之,通過(guò)上述研究結(jié)論提示 UERSA患者母胎界面蛻膜、絨毛MIF表達(dá)異常,可能在UERSA發(fā)生發(fā)展中起重要作用。我們可以嘗試對(duì)既往有 UERSA病史的患者進(jìn)行血清MIF篩查,血清 MIF水平降低者可預(yù)防性給予 MIF或其人工合成類(lèi)似物治療,可能提高其妊娠成功率,這將給 UERSA的預(yù)測(cè)和治療帶來(lái)新的突破。

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