羅 淵綜述 段連寧審校 （中國人民解放軍空軍總醫(yī)院臨床航空醫(yī)學(xué)實驗室,北京 100142）

NK-92細胞的研究和應(yīng)用進展①

羅 淵綜述 段連寧審校 （中國人民解放軍空軍總醫(yī)院臨床航空醫(yī)學(xué)實驗室,北京 100142）

惡性腫瘤是危害人類生命與健康的較為嚴(yán)重的常見病、多發(fā)病。針對腫瘤的治療方法有多種,其中,腫瘤生物治療中較成熟的是免疫細胞治療,尤以樹突狀細胞（DC細胞）和過繼性細胞（CIK細胞、LAK細胞、ANK細胞）治療效果為最好[1]。NK-92細胞是永生化的細胞系,能在體外有效殺傷許多腫瘤細胞系或從患者身上分離培養(yǎng)的原代腫瘤細胞,適宜用于過繼免疫治療。對其進行基因工程改造,可提高其殺傷活性、特異性和敏感性,有望使基因修飾過的NK-92細胞應(yīng)用于臨床治療,為人類克服腫瘤提供新的途徑。本文將對有望應(yīng)用于過繼性免疫治療（AIT）的NK-92細胞的研究和應(yīng)用進展作一綜述。

1 NK-92細胞的生物學(xué)特點

NK-92細胞是Klingemann HG實驗室于1992年從一名惡性非霍奇金淋巴瘤患者外周血分離并成功建系的大顆粒淋巴細胞。低濃度IL-2即可維持NK-92細胞的有效繁殖,而100 IU/ml的濃度可使其具有較強的細胞毒效應(yīng)。若培養(yǎng)環(huán)境中缺少IL-2,NK-92細胞將在72小時內(nèi)死亡。NK-92與NK細胞一樣,識別靶細胞無MHC限制性,可以在無預(yù)先致敏的情況下殺傷腫瘤細胞。同時,還可以產(chǎn)生一系列的細胞因子,進而對機體的獲得性免疫進行調(diào)節(jié),但也與NK細胞有諸多不同。我們將從細胞表面的調(diào)節(jié)性受體和相關(guān)分子的表達入手,對比分析NK-92細胞和普通NK細胞的生物學(xué)特點[2,3]。

1.1 受體-配體介導(dǎo)的細胞殺傷 NK細胞對靶細胞的殺傷活性與其細胞表面的受體和靶細胞表面的配體密切相關(guān),其中受體按功能不同可分為激活性受體（NKAR）、協(xié)同活化受體（co-stimulate receptors）和抑制性受體（NKIR）等。根據(jù)Karre[4]提出的“丟失自我假說”（Missing-self Hypothesis）,NK細胞主要清除那些丟失Ⅰ類主要組織相容性抗原（MHCⅠ類）的靶細胞,如病毒感染或惡性轉(zhuǎn)化的細胞。NK細胞這種分辨自己和異己細胞的能力來源于NK細胞上的抑制性殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIRs）對MHCⅠ類分子的識別和相互作用。通常,NK細胞至少表達一種抑制性KIR來識別自身正常細胞的MHCⅠ類分子,因為抑制性受體與配體的親和力高于激活性受體的,且傳遞信號能力更強,從而維持對自身的免疫耐受。一旦細胞出現(xiàn)MHCⅠ類分子的表達下調(diào),將導(dǎo)致NK抑制性信號下調(diào),從而打破了NK細胞的“動態(tài)平衡”狀態(tài),相對地就提高了NK細胞的激活性信號,最終導(dǎo)致了NK對靶細胞的殺傷效應(yīng)。

Maki等[3]通過 RT-PCR、抗體阻斷實驗、免疫印跡法和流式細胞術(shù)等方法對NK-92細胞表面的受體表達進行了研究,結(jié)果表明NK-92細胞具有典型的激活性NK細胞的免疫表型:CD2+、CD3-、CD4-、CD8-、CD56bright。KIR和NKG2受體家族都包含激活性和抑制性的成員,這主要取決于受體的跨膜區(qū)和胞漿區(qū)的結(jié)構(gòu)特點,抑制性受體的胞漿區(qū)較長,含有免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）,而激活性受體的胞漿區(qū)較短,且不含ITIM結(jié)構(gòu),但其跨膜區(qū)往往帶有含正電的氨基酸殘基（賴氨酸、精氨酸等）,可以和一些跨膜區(qū)含帶負電氨基酸的轉(zhuǎn)接蛋白（DAP10、DAP12等）非共價結(jié)合而傳遞激活性信號[5]。大多數(shù)的KIR都克隆性地表達在NK細胞上,但NK-92細胞只表達KIR 2DL4這一種。NK細胞表達所有的NKG2A-E和NKG2H,而NK-92表達大部分的NKG2家族受體。在自然細胞毒受體方面,NK細胞表達經(jīng)典的NKp46、NKp44和NKp30,而NK-92細胞雖然不表達NKp44,但還表達有 KIR 2DL4的同系物NKp49。此外,NK-92還表達大部分的協(xié)同活化受體和與信號傳導(dǎo)相關(guān)的一些粘附分子,甚至還表達一些不存在于普通NK的激活性受體和相關(guān)分子,如CD3ζ鏈等。與此截然相反的是,NK-92細胞表達的抑制性受體大大少于NK細胞的,如它不表達大部分的KIR、NKR-P1A、KLRG1等,而且有的受體即使表達,卻是極低水平的表達,如ILT-2等[3]。

眾多研究表明,NK（包括NK-92）在細胞殺傷機制方面是以顆粒酶-穿孔素介導(dǎo)的細胞毒作用為主的,因為一旦阻止了穿孔素的聚合反應(yīng),用4小時乳酸脫氫酶釋放實驗就檢測不到NK的殺傷活性[6]。而且,相對于新鮮分離或是經(jīng)IL-2激活的NK細胞,NK-92表達有更高水平的顆粒酶A,這也和它的大顆粒淋巴細胞的形態(tài)學(xué)特點相一致。

1.2 抗體依賴的細胞毒效應(yīng) NK細胞可以通過表面的CD16,即低親和力的免疫球蛋白Fc端受體（FcγRⅢα）,發(fā)揮抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxity,ADCC）。NK-92細胞不表達CD16,因此,它不能介導(dǎo)ADCC效應(yīng),也就限制了其在和單抗藥物聯(lián)合使用的潛在價值[6]。不過,NK-92細胞完全去除了ADCC的影響,可將它作為研究NK細胞介導(dǎo)的直接殺傷機制的模型。

1.3 誘導(dǎo)靶細胞凋亡 NK細胞介導(dǎo)的凋亡包括兩部分:一方面,通過活化caspase途徑及不依賴caspase途徑誘導(dǎo)細胞凋亡;另一方面,活化的NK細胞誘導(dǎo)CD95+、TNF受體陽性和TRAIL受體陽性的靶細胞通過內(nèi)源酶的級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn),NK-92細胞有FasL的mRNA轉(zhuǎn)錄,但是只有低蛋白水平的表達,當(dāng)用淋巴細胞刺激物（佛波酯PMA和伊屋諾霉素Ionomycin）作用時可導(dǎo)致FasL的高水平表達。有意思的是,NK-92細胞同時也高表達Fas受體,也許這參與了細胞自身的負反饋調(diào)節(jié)機制,以去除過多的活化細胞。此外,NK-92細胞還表達有其它的TNF家族成員[7],諸如TNF-α、TWEAK、TRAIL等,表明NK-92細胞可以通過誘導(dǎo)表達相應(yīng)受體的靶細胞凋亡來發(fā)揮強有力的殺傷作用。

2 NK-92細胞的應(yīng)用進展

近年來,隨著細胞克隆化技術(shù)的不斷成熟,相繼報道的NK細胞系有許多,但只有6種來自NK細胞瘤的NK細胞系是定性的,它們是經(jīng)過單克隆化、可以永久生存的大顆粒淋巴細胞,含有嗜苯胺藍顆粒和胚系TCR基因,具有NK 活性,如YT、NK-92、NKL、HANK-1、NK-YS、KHYG-1等。運用已建立的細胞系進行過繼免疫治療的主要優(yōu)勢在于,它們很容易在體外保存和擴增,避免了采用白細胞分離術(shù)的潛在副作用,而且還可以很方便地得到大量高純度、性能均一的效應(yīng)細胞。在這些細胞系中,尤以NK-92細胞最為突出,由于它幾乎缺失所有的KIRs,同時高表達一系列的激活性受體,且含有豐富的穿孔素和顆粒酶,因此它不但有很強的殺細胞效應(yīng),而且具有很廣的殺傷譜,使其成為臨床細胞過繼免疫治療的有力候選者,它也是唯一經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)進行臨床Ⅰ/Ⅱ期研究的NK細胞系。目前,NK-92細胞的應(yīng)用概況主要包括以下幾個方面:

2.1 NK-92直接殺傷腫瘤細胞的初步應(yīng)用 在NK-92細胞建立不久,Yan等[8]就對其在體外和體內(nèi)對血液來源的腫瘤細胞的細胞毒效應(yīng)進行了研究。通過鉻51釋放試驗（CRA）,檢測NK-92對46份來源于各種白血病患者的原代腫瘤細胞的殺傷效果,其中包括12例急性髓性白血?。ˋML）、7例T系急性淋巴細胞白血?。═-ALL）、14例B系急性淋巴細胞白血病（B-ALL）和13例慢性髓性白血?。–ML）,結(jié)果表明,當(dāng)效應(yīng)細胞∶靶細胞（效靶比,E∶T）為9∶1時,共有24份（占52.2%）患者腫瘤細胞表現(xiàn)出對NK-92敏感或高度敏感,包括6例AML、7例T-ALL、5例B-ALL和6例CML。而對八種人類白血病細胞系（K562 、KG1 、HL60 、Raji、NALM6 、TALL-104 、CEM-S 和CEM-T）的殺傷實驗表明,NK-92細胞對以上細胞系均具有很高的細胞毒效應(yīng)。同批次的對照實驗顯示,18份來源于正常供者的骨髓造血細胞對NK-92介導(dǎo)的細胞殺傷均不敏感,表明NK-92不殺傷機體內(nèi)正常的細胞。Yan等[8]也對NK-92在重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠體內(nèi)的過繼免疫治療效果進行了研究,結(jié)果表明NK-92在活體內(nèi)的細胞毒效應(yīng)和活體外的具有很好的一致性,因此可根據(jù)體外實驗對相應(yīng)體內(nèi)的過繼免疫治療效果進行預(yù)測評估。

Romanski等學(xué)者[9]進行了ALL對NK-92敏感性的機制研究,發(fā)現(xiàn)盡管NK-92缺失幾乎所有的抑制性受體（除了KIR 2DL4）,但仍有一部分ALL對其不敏感。盡管部分ALL細胞表達非經(jīng)典的MHCⅠ類分子HLA-G（KIR 2DL4的受體）,但并不介導(dǎo)其對NK-92的耐受,似乎與傳統(tǒng)觀點相悖。相反地,對NK敏感的T-ALL（MOLT-4）表達有中等水平的MHCⅠ類分子相關(guān)蛋白（M ICA/B）,它們是激活性受體NKG2D的配體,而對NK抵抗的B-ALL卻不表達M ICA/B。說明ALL對NK-92的抵抗與其抑制性受體介導(dǎo)的機制關(guān)系不大,而與激活性受體介導(dǎo)的激活信號沒有被充分激活有關(guān),因此,為了提高ALL對NK細胞的敏感性,應(yīng)將重點集中在如何激活NK細胞上,這與Reid等[10]的研究結(jié)果相一致。體外實驗表明NK-92對許多黑素瘤細胞系的殺傷效果均強于LAK細胞,尤其是低效靶比時。在SCID小鼠體內(nèi)進行的殺傷實驗表明,靜脈輸注NK-92的荷瘤小鼠生存期增加了1.5～2.5倍,而若在輸注腫瘤細胞前注射可自分泌IL-2的NK-92CI或NK-92MI可使小鼠存活期增加2.5～5倍左右。通過向小鼠背部皮下注射MEWO和WM 1341黑色素瘤細胞株后,可形成原位腫瘤、繼發(fā)腫瘤和可遷移的癌細胞,通過輸注NK-92可使腫瘤組織縮小30～90%,表明NK-92細胞有潛力成為過繼免疫治療的效應(yīng)細胞。還有研究表明,NK-92可作為自體移植的“清除劑”,可有效減少甚至去除自體移植物中的惡性細胞,且不會對造血祖細胞產(chǎn)生副作用,從而大大提高自體移植的效果[11]。

2.2 對NK-92進行基因工程改造的應(yīng)用 NK-92細胞的生長繁殖和殺細胞效應(yīng)的有效發(fā)揮均依賴于IL-2的存在,若要利用NK-92進行過繼免疫治療,則需同時注射IL-2,而外源性IL-2可能會產(chǎn)生一些毒副作用,因此需對IL-2的劑量濃度進行精細計劃。Konstantinidis等[12]通過基因修飾的方法,將IL-2基因轉(zhuǎn)染進入NK-92細胞,但它不向細胞外分泌,而是合成后定位于細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū),能夠保持良好的自體活化,且其殺傷活性不受影響,從而既不需外源的IL-2也不向細胞外分泌IL-2,有效避免了IL-2可能產(chǎn)生的副作用。

一般來說,NK-92細胞對大部分血液來源的腫瘤細胞具有較強的殺傷能力,而對實體瘤來源的惡性細胞缺乏有效殺傷。如前所述,NK細胞對靶細胞的殺傷沒有MHC限制性,且不需TCR或BCR的參與,屬于非特異性殺傷。因此,為了使NK細胞能夠更加特異地對腫瘤細胞進行殺傷,許多學(xué)者嘗試著將針對腫瘤相關(guān)抗原的特異抗體表達在NK細胞表面上,從而使其對靶細胞的殺傷能力大大增強。Uherek等[13]將表達嵌合抗原受體的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染NK-92細胞,篩選出的穩(wěn)定株即可持續(xù)表達針對ErbB2原癌基因產(chǎn)物（HER2/neu）的嵌合分子,該嵌合分子由從N端到C端依次為免疫球蛋白重鏈信號肽、ErbB2抗體的單鏈可變區(qū)片段（scFv）、CD8α絞鏈區(qū) 、CD3ζ（zeta）鏈 。殺傷實驗表明,對于ErbB2表達陽性的惡性細胞（如MDA-MB453）,改造后的NK-92細胞具有很強的殺傷效應(yīng),而初始NK-92不能殺傷;而對于ErbB2表達陰性的腫瘤細胞（如K562）,則改造前后的殺傷活性變化不大。進一步的實驗表明,改造后的NK-92細胞對不同的上皮源性惡性細胞系的殺傷能力與其表達ErbB2的水平相一致;而且即使在較低的效靶比（3∶1）時,高表達ErbB2的腫瘤細胞（如SKBR3）仍能被迅速誘導(dǎo)凋亡。除了腫瘤細胞系外,還對來源于人乳腺癌的原代惡性腫瘤細胞（ErbB2+）進行了實驗,結(jié)果表明改造后的NK-92具有很強的殺傷能力,而初始NK-92則幾乎不能殺傷。此外,作者還利用CD-1裸鼠進行了活體內(nèi)實驗,結(jié)果表明改造后的NK-92細胞可明顯抑制腫瘤的生長。Muller等[14]也進行了相關(guān)的研究,他們將NK-92改造成表達CD20特異的嵌合抗原受體,從而使原先對NK-92不敏感的濾泡性淋巴瘤和急性B前體細胞白血病逆轉(zhuǎn)成對改造的NK-92高度敏感,而且與腫瘤細胞表面的CD20表達量正相關(guān)。由此可見,通過嵌合受體改造,可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對免疫效應(yīng)細胞的耐受性,從而為殺傷腫瘤并最終治愈腫瘤提供了一條有效途徑。

2.3 NK-92在臨床上的初步應(yīng)用 由于NK-92細胞的諸多優(yōu)點,它是第一個進入臨床用于治療晚期癌癥的NK細胞系。Tam等[15]的研究表明,當(dāng)γ射線的照射劑量為500 cGy時,可以在阻止NK-92繁殖分裂的同時保持其高殺傷活性,即使照射劑量提高到1 000 cGy,仍可在48小時內(nèi)保持其殺傷活性。Tonn等[16]對NK-92應(yīng)用于臨床可能產(chǎn)生的問題做了全面的研究,確定了GMP條件下大規(guī)模擴增培養(yǎng)NK-92細胞的最佳培養(yǎng)條件和操作程序,并對7名晚期癌癥患者進行了臨床Ⅰ期實驗,每名患者輸注兩次NK-92 細胞,劑量不一（109、3×109、5×109等）,前后隔48小時,結(jié)果顯示個別患者出現(xiàn)低熱、背痛等不適反應(yīng),但總體來說每名患者輸注3×109/m2γ射線照射過的NK-92都是安全的,至于NK-92在晚期癌癥中的功效,還有待進一步的深入實驗。同時,為了研究受者是否會排斥輸注的NK-92細胞,Tonn T分別進行了微量淋巴毒實驗和T淋巴細胞活化標(biāo)志CD69的檢測,結(jié)果表明輸注NK-92細胞不會引起受者的排斥反應(yīng),不過這也可能是由于受者已處于免疫缺陷狀態(tài)引起的,還有待后續(xù)深入研究。此外,美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)進行了一些NK-92的臨床治療惡性黑色素瘤和腎癌的研究,但都還沒有取得最終的結(jié)果,而且樣本量都比較小,還有待于進一步的完善和驗證。

3 小結(jié)及前景展望

NK-92細胞具有類似于激活性NK細胞的特點。細胞表面幾乎缺失所有的識別并結(jié)合HLA-Ⅰ類分子的KIRs（只表達KIR 2DL4）,同時表達有豐富的激活性受體、協(xié)同活化受體、誘導(dǎo)凋亡的分子和粘附相關(guān)分子等,因此NK-92具有很高的殺細胞活性和很廣的靶細胞譜,適宜用于過繼免疫治療。對NK-92細胞進行基因工程改造,可大大提高其殺傷活性、特異性和敏感性。NK-92過繼免疫治療臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗,積累了有價值的實驗數(shù)據(jù)和經(jīng)驗。相信,隨著腫瘤相關(guān)抗原的不斷發(fā)現(xiàn)、腫瘤逃逸機體免疫系統(tǒng)殺傷機制的逐漸明確、NK細胞受體配體作用機制的不斷深入和安全高效的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的出現(xiàn)[17],有望使NK-92細胞盡早應(yīng)用于臨床治療,為克服腫瘤提供新的途徑。

1 Arai S,Klingemann H G.Naturalkiller cells:can they be useful asadoptive immunotherapy for cancer?[J].Expert Opin Biol Th,2005;5（2）:163-172.

2 Biassoni R,Dimasi N.Human natural killer cell receptor functions and their implication in diseases[J].Expert Rev Clin Immunol,2005;1（3）:405-417.

3 MakiG,Klingemann H G,Martinson JAetal.Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line,NK-92[J].JHematother Stem Cell Res,2001;10（3）:369-383.

4 Karre K,Ljunggren H G,Piontek Getal.Selective rejection ofH-2-deficient lymphomavariants suggests alternative immune defense strategy[J].Nature,1986;319:675-678.

5 Vivier E,Nunes JA,Vely F.Natural killer cell signaling pathways[J].Science,2004;306（5701）:1517-1519.

6 Pores-Fernando A T,Gaur S,Doyon M Yetal.Calcineurin-dependent lytic granule exocytosis in NK-92 natural killer cells[J].Cell Immunol,2009;254（2）:105-109.

7 Yu M X,ShiW F,Zhang Jetal.Influence of reverse signaling viamembrane TNF-αon cytotoxicity of NK-92 cells[J].Eur JCell Biol,2009;88（3）:181-191.

8 Yan Y,Steinherz P,KlingemannH Getal.Antileukem ia activity ofa naturalkiller cell lineagainst human leukem ias[J].ClinCancer Res,1998;4（11）:2859-2868.

9 Romanski A,Bug G,Becker Setal.Mechanismsof resistance to natural killer cell-mediated cytotoxicity in acute lymphoblastic leukem ia[J].Exp Hematol,2005;33（3）:344-352.

10 Reid G SD,Bharya S,K lingemann H Getal.Differentialkilling ofpre-B acute lymphoblastic leukem ia cells by activated NK cellsand the NK-92 ci cell line[J].Clin Exp Immunol,2002;129（2）:265-271.

11 Maki G,Tam Y K,Berkahn Letal.Ex vivo puring with NK-92 prior to autografting for chronic myelogenous leukem ia[J].Bone Marrow Transpl,2003;31（12）:1119-1125.

12 Konstantinidis K V,Alici E,Aints Aetal.Targeting IL-2 to the endoplasm ic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92 cells[J].Exp Hematol,2005;33（2）:159-164.

13 Uherek C,Tonn T,Uherek Betal.Retargeting of natural killer-cell cytolyticactivity to ErbB2-expressing cancer cells results in efficient and selective tumor celldestruction[J].Blood,2002;100（4）:1265-1273.

14 Muller T,Uherek C,Maki Getal.Expressiong of a CD20-specific chimeric antigen receptor enhances cytotoxic activity of NK cells and overcomesNK-resistance of lymphoma and leukemia cells[J].Cancer Immunol Immun,2008;57（3）:411-423.

15 Tam Y K,Martinson JA,Doligosa Ketal.Ex vivo expansion of the highly cytotoxic human natural killer-92 cell-line under current good manufacturing practice conditions for clinical adoptive cellular immunotherapy[J].Cytotherapy,2003;5（3）:259-272.

16 Tonn T,Becker S,Esser Retal.Cellular immunotherapyofmalignancies using the c lonal natural killer cell line NK-92[J].JHematother Stem Cell Res,2001;10（4）:535-544.

17 Grund EM,Muise-Helmericks R C.Cost efficient and effective gene transfer into the human natural killer cell line,NK-92[J].J Immunol Methods,2005;296（1-2）:31-36.

[收稿2009-07-11 修回2009-08-06]

（編輯 倪 鵬）

R392

A

1000-484X（2010）01-0085-04

①本文受國家自然科學(xué)基金項目（No.30873014）資助

羅 淵（1982年-）,男,碩士;

及指導(dǎo)教師:段連寧（1964年-）,男,博士,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,主要從事造血干細胞移植治療惡性血液病的臨床與基礎(chǔ)研究,E-mail:duanln@tom.com。