劉艷群 杜先智 (重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,重慶400010)

·免疫學技術與方法·

應用抑制消減雜交技術構建結核分枝桿菌差異表達基因消減cDNA文庫①

劉艷群 杜先智 (重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,重慶400010)

目的:構建結核分枝桿菌H37Rv與H37Ra的差異表達基因消減文庫,分離結核分枝桿菌差異表達cDNA片段。方法:利用抑制性消減雜交技術分析結核分枝桿菌強毒株H37Rv和弱毒株H37Ra的基因組mRNA的表達差異,并進行兩輪消減雜交和兩次PCR,將第二次PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體相連,電擊轉化大腸桿菌 E.coli DH5α進行文庫擴增和藍白斑篩選,RTPCR鑒定差異表達文庫。結果:以結核分枝桿菌強毒株H37Rv的cDNA為檢測子的正相雜交和以弱毒株H37Ra的cDNA為檢測子的反相雜交各自高表達或特異性表達的片段都得到選擇性擴增,成功構建了差異表達cDNA文庫A庫和B庫。所長出的菌落中90%為白色克隆,其中單一條帶的克隆占75%和80%,片段大小集中在100～800 bp之間。結論:利用SSH技術成功構建了結核分枝桿菌強毒株H37Rv和弱毒株H37Ra差異表達基因消減cDNA文庫,該消減文庫的建立為進一步篩選、克隆這兩種菌株之間差異表達的新基因奠定了基礎。

分枝桿菌,結核;抑制性消減雜交;cDNA文庫

抑制消減雜交(Suppression subtractive hybridization,SSH)是20世紀90年代末出現(xiàn)的一種新的篩選差異表達基因技術,此技術應用兩次消減雜交和兩次抑制性PCR,在消減雜交過程中使豐度不同的cDNA拷貝數(shù)趨于平衡,靈敏度提高,保證了較低豐度的差異表達基因也得到有效的克隆,與其它差異基因分離方法相比表現(xiàn)了獨特的優(yōu)越性[1]。

結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是肺結核的病原菌,盡管目前有可以選擇的治療方法,但是每年仍然有兩百萬人死于肺結核。目前大約有三分之一的人感染了MTB,每年有七百萬到八百萬新發(fā)肺結核病例[2]。通過比較基因組之間的差異,探索結核分枝桿菌的致病分子機理、篩選結核致病菌的毒力基因、尋找及鑒定結核分枝桿菌毒力基因成為研究熱點[3]。本研究選擇結核分枝桿菌強毒株H37Rv和弱毒株H37Ra為SSH的研究對象,成功構建了這兩種菌株之間差異表達基因的消減cDNA文庫,為進一步篩選、克隆其差異表達的新基因奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 結核分枝桿菌強毒株H37Rv(ATCC27294)由重慶市結核基因診斷中心實驗室提供,弱毒株H37Ra(ATCC25177)由重慶醫(yī)科大學免疫教研室提供。pGEM-T載體(Promega公司)用于DNA片段的克隆及其上的插入片段的分析。E.coli DH5α(上海迪奧生物科技有限公司)用于載體的克隆。米氏7H9液體培養(yǎng)基(法國梅里埃公司)用于分枝桿菌的培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 PCR-selectTMcDNA subtraction kit購自日本Clontecth公司,Trizol RNA提取試劑和SuperscriptⅡ反轉錄酶購自Invitrogen公司,T4 DNA連接酶、EcoRⅠ、RsaⅠ、pGEM-T載體購自Promega公司,PCR Product Purification K it、Taq DNA polymerase、溶菌酶、蛋白酶K、DNA marker DL2500均購自日本TaKaRa公司產(chǎn)品,引物的合成、dNTP均由上海迪奧生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 結核分枝桿菌培養(yǎng) 分枝桿菌接種于米氏7H9液體培養(yǎng)基,在生物安全柜中操作,按法國梅里埃公司米氏7H9培養(yǎng)基要求說明,將接種后的培養(yǎng)瓶置于法國梅里埃公司BacTALERT○RMP處理系統(tǒng)進行快速液體培養(yǎng),37℃,約2～3周,每周觀察一次。H37Rv與H37Ra各10瓶,每瓶10 ml,同時封口,標記。

1.2.2 結核分枝桿菌RNA抽提及純化 按無菌操作原則,取上述菌液各100 ml,高速離心至結核分枝桿菌完全沉淀。去除上清,再離心一次,用加樣槍吸取上清。沉淀收集后分別加入1 ml Trizol(按試劑盒說明書操作),室溫靜置10～15分鐘,充分裂解細胞。加200μl氯仿,充分混勻,15 000 r/min離心5～7分鐘。取上清,至1.5 ml EP管加500μl異丙醇,混勻,15 000 r/min離心10分鐘。棄上清,用1 ml 75%乙醇沖洗,高速離心5分鐘。棄上清,RNA沉淀于空氣中干燥2～3分鐘,將干燥后的RNA溶解于DEPC水中,分別提取H37Rv和H37Ra的總RNA。經(jīng)DNA酶處理后稀釋400倍做紫外分析測定,并取少量做凝膠電泳檢測鑒定。按TaKaRa公司PCR Product Purification K it操作說明,對檢測符合要求的各管進行RNA純化。

1.2.3 抑制性消減雜交 通過mRNA逆轉錄為cDNA,cDNA用RsaⅠ四堿基限制性內(nèi)切酶消化為0.1～1 kb的片段,接頭連接,進行消減雜交:以 H37Rv cDNA為檢測子,H37Ra cDNA為驅動子的為正相雜交;以H37Ra cDNA為檢測子,H37Rv cDNA為驅動子的為反相雜交。采用Clontech公司的PCR-selectTMcDNA subtraction kit進行抑制消減雜交,原理詳見[3,4]。具體按說明書進行操作并進行適當調(diào)整。進行兩次雜交及兩次選擇性的PCR擴增。

1.2.4 cDNA消減文庫的構建 正反兩相消減雜交第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,分別取3μl經(jīng)T4 DNA連接酶與pGEM-T載體(Promega公司)16℃連接過夜,乙醇沉淀濃縮成4μl,電擊轉化到大腸桿菌E.coli DH5α中,冰浴30分鐘,42℃1.5分鐘,重置于冰上2分鐘,加入500μl SOC培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)1小時。將含100μl/ml氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基使用前涂10μl濃度為100 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和20μl濃度為50 mg/ml的XGal,作為藍白斑篩選平板。離心轉化產(chǎn)物,取沉淀涂于藍白斑篩選平板,37℃過夜,構建正相和反相消減文庫A庫和B庫。

1.2.5 消減文庫的擴增及鑒定 隨機挑取A庫和B庫白色菌落100個,接種于含100μl/ml氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基,37℃輕搖過夜,各取1μl菌液作為RT-PCR模版進行擴增鑒定。以Nest primer 1R及Nest primer 2R作為引物,PCR擴增插入片段。20 μl的反應體系:模板1μl、Nest primer 1R(10μmol/L) 1μl、Nest primer 2R(10μmol/L)1μl、dNTP(25 mmol/L each)2μl、10×PCR buffer 2μl、Taq酶0.2 μl,補H2O至總體積20μl。反應程序:95℃5分鐘, 94℃15秒,65℃30秒,72℃90秒,72℃10分鐘后保存在4℃。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 結核分枝桿菌RNA抽提結果 紫外分光檢測RNA核酸260 nm和280 nm處的吸收值,測得國際標準強毒株H37Rv株的基因組OD260/OD280比值和弱毒株 H37Ra基因組OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間,可以認為樣品較純,沒有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的污染。1.5%瓊脂糖凝膠電泳可清晰看見RNA條帶清晰明亮,無彌散拖尾現(xiàn)象,見圖1。

2.2 消減雜交結果分析 H37Rv和H37Ra RNA通過mRNA逆轉錄為cDNA,cDNA經(jīng)RsaⅠ四堿基限制性內(nèi)切酶消化為0.1～1 kb的片段,然后進行消減雜交:以H37Rv cDNA為檢測子,H37Ra cDNA為驅動子的為正相雜交;以H37Ra cDNA為檢測子, H37Rv cDNA為驅動子的為反相雜交,進行兩輪雜交和兩次PCR擴增。

圖2為正、反相消減雜交第一次PCR擴增結果,1泳道為正相消減雜交第一次PCR擴增結果,2泳道為反相消減雜交第一次PCR擴增結果。從圖中可以看出正反兩相消減雜交第一次PCR擴增的電泳帶較弱,僅在100～400 bp之間看見較弱的條帶。圖3為正反相消減雜交第二次PCR擴增結果, 1泳道為正相消減雜交第二次PCR擴增結果,2泳道為反相消減雜交第二次PCR擴增結果。從圖中可以看出經(jīng)過兩輪消減雜交和兩輪抑制性PCR,正反兩相消減雜交Tester中的差異表達基因都得到有效的富集和擴增,可以看見明顯的電泳條帶,位于100～800 bp之間,說明消減雜交是成功的。

2.3 SSH文庫的構建 正反兩相消減雜交第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,經(jīng)T4 DNA連接酶與pGEM-T載體連接,電擊轉化到大腸桿菌E.coli DH5α中構建質(zhì)粒載體文庫A庫和B庫。平皿上可見藍白分明的菌落(圖4)。所長出的菌落中,90%為白色菌落。剩余菌液加甘油,液氮速凍后,-70℃保存。

圖1 抽提RNA結果Fig.1 The result of RNA abstraction

圖2 消減雜交后第一次PCR擴增產(chǎn)物分析Fig.2 The first PCR products of subtractive hybridization

圖3 消減雜交后第二次PCR擴增產(chǎn)物分析Fig.3 The second PCR products of subtractive hybridization

圖4 SSH文庫轉化結果Fig.4 Transformation result of SSHLibrary

圖5 A庫部分克隆PCR鑒定(從左至右為A1-24白色克隆)Fig.5 Identification of some recombinants in the correctitude subtractive hybridization Library by using PCR

圖6 B庫部分克隆PCR鑒定(從左至右為B1-24白色克隆)Fig.6 Identification of some recombinants in the reverse subtractive hybridization Library by using PCR

2.4 陽性轉化子的PCR鑒定結果 消減產(chǎn)物克隆到T-easy載體上,所長出菌落中90%為白色克隆。對所有白色克隆用Nested primer 1R和Nested primer 2R為引物進行PCR擴增后分析均有條帶在100～800 bp之間呈隨機分布。

圖5、6分別顯示了A庫和B庫的24個克隆的PCR擴增的情況。圖5為正相消減雜交文庫A庫中隨機挑取的白色菌落的PCR擴增情況,所挑取的24個白色克隆75%為單一條帶。同樣,圖6為反相消減雜交文庫B庫的PCR擴增情況,80%為單一條帶,說明這些克隆中均可能含有結核分枝桿菌H37Rv和 H37Ra各自獨有的特異性表達的cDNA片段。

3 討論

近幾年,隨著PCR技術的出現(xiàn),涌現(xiàn)了許多基于PCR的分離有差別表達基因的新方法。如mRNA差異顯示技術(mRNA differential display reverse transcription PCR或DD)、代表性差示分析技術(representational difference analysis,RDA)、交互差減RNA差別顯示技術(reciprocal subtraction differential RNA display,RSDD)及SSH技術。SSH是Diatchenko等[4]于 1996年依據(jù)消減雜交和抑制性PCR發(fā)展起來的一種分離差異表達基因的方法。該方法最早應用于真核生物mRNA差異表達基因的研究中。1998年應用于原核生物基因組差異比較的研究中。因其具有操作簡單且篩選效率高等優(yōu)點,Akopyants等[5]首次將該方法進行改良并用于細菌基因組比較分析。目前已成功地運用到豬鏈球菌毒力株與無毒株[6]、大腸桿菌與沙門桿菌[7]等微生物基因組的差異基因表達分析中,并獲得了多種細菌的毒力基因及致病相關基因。證明SSH為分離差異表達基因的有效方法,為病原體中未知的毒力基因(致病島)篩選和微生物基因組差異、分子進化的研究提供了重要技術手段。

結核分枝桿菌毒力基因的尋找與鑒定是結核分枝桿菌致病機制研究的重點。通過SSH構建結核菌株之間的差異表達基因文庫可以為上述研究奠定基礎。并且利用SSH構建的消減文庫具有突出的優(yōu)點:該技術經(jīng)過兩輪消減雜交及兩次抑制性PCR,使Tester中代表差異表達基因的cDNA片段得到大量擴增,同時抑制了非特異性cDNA片段的擴增,使各種消減文庫的特異性得到極大的提高。且在進行陽性克隆篩選時可結合高通量的篩選方法如基因芯片、高密度點陣膜等。Mahairas等[8]以BCG基因組片段與H37Rv基因組酶切產(chǎn)物進行消減雜交,發(fā)現(xiàn)BCG中缺少3個獨立基因區(qū)RD1、RD2、RD3,認為這些基因的缺失導致BCG毒力的減弱。Brosch等[9]先分析了H37Rv和H37Ra基因組酶切產(chǎn)物多態(tài)性的不同,再選擇了有差異的酶切片段標記探針,并與兩者基因組酶切產(chǎn)物雜交,發(fā)現(xiàn)在H37Rv的基因Rv1755c中IS6110插入序列的插入位置與H37Ra的不同,并證實在H37Ra基因組中也有類似BCG中RD2區(qū)域的存在。

我們以結核分枝桿菌強毒株H37Rv和H37Ra為研究對象,以H37Rv cDNA為檢測子,H37Ra cDNA為驅動子的為正相雜交;以H37Ra cDNA為檢測子, H37Rv cDNA為驅動子的為反相雜交,進行兩輪消減雜交和兩次抑制性PCR,使Tester與Driver中共有基因的cDNA片段得到有效消減,而存在于Tester中的特異性表達基因得到特異性擴增。利用T/A克隆技術,將特異性擴增的PCR產(chǎn)物與T載體進行連接,轉化至感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5α中,成功構建了正相消減文庫A庫和反相消減文庫B庫。文庫經(jīng)擴增后,經(jīng)藍白斑初步篩選,隨機挑取白色菌落進行繁殖。菌液經(jīng)RT-PCR鑒定,結果顯示A庫75%的克隆為單一條帶,為100～800 bp之間的插入片段,B庫80%的克隆為單一的條帶,為100～600 bp之間的插入片段,說明這些克隆中均可能含有結核分枝桿菌H37Rv和H37Ra各自獨有的特異性表達的cDNA片段。我們已經(jīng)從A庫和B庫中各自篩選出一批克隆,目前正在測序。在下一步的實驗中,我們將對篩選出來的克隆進行特異性鑒定及功能分析,以明確所篩選的特異性片段的功能及表達特征,希望找出強毒株H37Rv獨有的且以前未曾發(fā)現(xiàn)的保護性抗原,以期構建新型結核粘膜疫苗。結核分枝桿菌H37Rv和H37Ra基因消減文庫的構建,不僅大大減少了用Northern雜交、RT-PCR等技術進一步篩選、鑒定其特異性基因的盲目性,提高了特異性,而且為揭示結核分枝桿菌的致病機理、毒力基因尋找及基因診斷、基因治療奠定了基礎。

1 Ji W,Wright MB,Cai Let al.Efficacyof SSH PCR in isolating differentially expressed genes[J].BMC Genomics,2002;20:3-12.

2 Michaela A,Gazdik A,Kathleen Aet al.Identification of cyclic AMPRegulated genes in Mycobacterium tuberculosis complex bacteria under Low-Oxygen conditions[J].Journal of Bacteriology,2005;187(8):2681-2692.

3 Huang XW,Li YX,Niu Q Het al.Suppression subtractive Hybridization (SSH)and its modifications in microbiological research[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007;76(4):753-760.

4 Diatchenko L,Lau Y F,Campbell A Pet al.Suppression subtraction hybridization:a method for generating differentially regulated or tissue specific cDNA probes and libraries[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996;93: 6025-6030.

5 Akopyants N S,Fradkov A,Diachenko Let al.PCR-based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helicobacterpylori[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998;95:13108-13113.

6 田 云,Frank M A,陸承平.豬鏈球菌2型可能的毒力基因的發(fā)現(xiàn)[J].微生物學報,2004;44(5):613-616.

7 Bogush ML,Velikodvorskaya T V,Lebedev YBet al.Identification and localization of differences between Escherichia coli and Salmonella typhimurium genomes by suppressive subtractive hybridization[J].Mol Gen Genet,1999;262(4-5):721-729.

8 Mahairas G G,Sabo PJ,Hickey MJet al.Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent bovis[J].J Bacterial,1996;178(5):1274-1282.

9 Brosch R,Philipp W J,Stavropoulos Eet al.Genomic analysis reveals variation between Mycobacterium tuberculosis H37Rv and the attenuated M tuberculosis H37Ra strain[J].Infect Immun,1999;67(11):5768-5774.

[收稿2009-07-25 修回2009-07-29]

(編輯 倪 鵬)

Construction of subtracted cDNA library by suppression subtracted hybridization for differentially expressed genes in Mycobacterium tuberculosis

LIU Yan-Qun,DU Xian-Zhi.Department of Respiratory Medicine,the Second Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing400010,China

Objective:T o isolate Mycobacterium tuberculosis H37Rv and H37Ra genes especially,and to construct two cDNA libraries by using suppression subtractive hybridization(SSH).Methods:We used suppression subtractive hybridization(SSH)to clone the differential genomic genes between Mycobacterium tuberculosis virulence strain H37Rv and attenuated strain H37Ra.After two times of subtractive hybridization and two times of PCR,the products of last PCR amplification were inserted into pGEM-T Easy vector and be transformed into the E.coli DH5αand screened of blue and white clones of the transformants.The subtracted cDNA library of differentially expressed genes were identified by RT-PCR.Results:High or especially expressed genes as tester had been obtained by SSH in correctitude reaction(H37Rv as tester)and reverse reaction(H37Ra as tester),the cDNA librariesof A and B of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and H37Ra were successfully constructed.90%of the colonies were white clones,the single band of the colonies was 75%and 80%.Conclusion:The cDNA libraries of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and H37Ra were successfully constructed using SSH technique,which lay a solidfoundationfor screening and cloning new specific differentially expressed genes in them.

Mycobacterium tuberculosis;Suppression subtractive hybridization;cDNA library

R328 文獻標識碼 A 文章編號 1000-484X(2010)01-0061-05

①本文為國家自然科學基金資助項目(No.30872261)

劉艷群(1974年-),女,碩士,主要從事結核與免疫方面研究;

及指導教師:杜先智(1964年-),男,教授,碩士生導師,主要從事結核病防治方面的研究,E-mail:dxzdjy868@sina.com。