千智斌,宋曉榮,姬明麗

(河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院:1.機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室;2.病理生理學(xué)教研室 453003)

尼可剎米對新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元鈉通道的興奮作用

千智斌1,宋曉榮2,姬明麗2

(河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院:1.機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室;2.病理生理學(xué)教研室 453003)

目的觀察尼可剎米對新生大鼠皮層神經(jīng)元電壓依賴性鈉通道的作用。方法應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察尼可剎米對新生大鼠腦片皮層神經(jīng)元電壓依賴性鈉電流的作用。結(jié)果尼可剎米增加皮層神經(jīng)元河豚毒素(TTX)敏感性電壓依賴鈉電流;尼可剎米使鈉通道穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化方向移動,鈉通道半數(shù)激活電壓(V1/2)從給予尼可剎米前的(-34.67±3.07)mV變?yōu)榻o予尼可剎米后的(-37.63±3.37)mV(n=10,P＜0.05);尼可剎米使鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活曲線向去極化方向移動,鈉通道半數(shù)失活電壓(V1/2)從給予尼可剎米前的(-43.36±3.06)mV變?yōu)榻o予尼可剎米后的(-33.24±2.05)mV(n=10,P＜0.01)。結(jié)論尼可剎米通過改變皮層神經(jīng)元鈉通道的動力學(xué)特征來增加電壓依賴性鈉電流,這可能是尼可剎米興奮中樞神經(jīng)元的作用機(jī)制之一。

尼可剎米;皮層神經(jīng)元;全細(xì)胞膜片鉗;鈉通道

電壓依賴性鈉通道在細(xì)胞動作電位產(chǎn)生和傳播過程中起著十分重要的作用,是快反應(yīng)細(xì)胞的功能基礎(chǔ)[1]。許多資料表明,鈉通道結(jié)構(gòu)和功能的改變與神經(jīng)元正常功能和多種疾病密切相關(guān)[2-3]。大腦皮層是運(yùn)動、感覺、意識、情緒、語言、學(xué)習(xí)和記憶的高級中樞,大腦皮層結(jié)構(gòu)和功能的正常是個體健康存活的前提。尼可剎米是臨床治療上常用的非特異性呼吸中樞興奮劑,臨床上過量使用尼可剎米引起中樞興奮、精神錯亂、惡心、嘔吐、抽搐、血壓升高、心律失常、驚厥等不良反應(yīng)。為明確尼可剎米對新生大鼠皮層神經(jīng)元鈉通道的作用機(jī)制,分析尼可剎米對皮層神經(jīng)元功能的影響,本研究使用新生大鼠全腦腦片,應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察尼可剎米對皮層神經(jīng)元鈉通道的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級Sprague-Dawley大鼠10只,日齡1～3 d,雌雄不限,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 試劑 CsCl、TEACl、CaCl2、EGTA、MgCl2、Na2ATP 、HEPES購自Sigma公司,河豚毒素(T TX)購自河北水產(chǎn)研究所,其余為國產(chǎn)分析純。人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF,in mmol/L):NaCl 124 mmol/L,KCl 5 mmol/L,MgSO41.3 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,CaCl22 mmol/L,NaHCO326 mmol/L,葡萄糖30 mmol/L。電極內(nèi)液 (microelectrode internal solution,MIS,in mmol/L):CsCl 110 mmol/L,TEACl 30 mmol/L,CaCl21 mmol/L,EGTA 10 mmol/L,MgCl22 mmol/L,Na2ATP 4 mmol/L,HEPES 10 μ mol/L,用CsOH調(diào)節(jié)pH值至7.2,-20℃保存。

1.3 大鼠海馬腦片標(biāo)本制備 新生大鼠乙醚麻醉后斷頭取腦、腦修切立即固定于震動切片機(jī)(LEICA VT1000S德國)的切片槽內(nèi),內(nèi)盛0℃ACSF并持續(xù)通95%O2和5%CO2混合氣,該操作在1 min內(nèi)完成。利用震動切片機(jī)冠狀切取厚400 μ m包含完整海馬的腦片,將腦片轉(zhuǎn)移至持續(xù)通 95%O2和 5%CO2混合氣的孵育槽中,34℃孵育30 min后常溫孵育。記錄時將腦片轉(zhuǎn)移至記錄槽中并使用粘有尼龍絲的白金框固定腦片。保持溫度在 27～29℃,記錄槽容積8 mL,記錄槽中ACSF使用蠕動泵循環(huán),流速為6～8 mL/min。

1.4 全細(xì)胞膜片鉗記錄 在紅外微分干涉相差顯微鏡(600-FN,NIKON,日本)下選擇內(nèi)錐體細(xì)胞層(internal pyramidal layer)邊緣清晰、立體感強(qiáng)、胞質(zhì)均勻、軸突樹突較長的神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄(n=10)。記錄電極外徑1.5 mm(南京六合泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材有限公司,中國),使用微電極拉制儀(P-97,Sutter,美國)多步水平拉制而成,并使用拋光儀(MF-830,NARISHIGE,日本)拋光。電極尖端內(nèi)徑2～ 3 μ m,充灌內(nèi)液電極后加少許正壓后阻抗為2～4 MΩ。在顯微鏡下操縱微電極接近神經(jīng)元,當(dāng)電極電阻升高0.1 M Ω或觀察到神經(jīng)元細(xì)胞膜被電極尖端正壓“沖”出痕跡時,立即撤去正壓并給少許負(fù)壓,封接電阻急劇上升,當(dāng)封接電阻上升至1 GΩ以上時,微電極與細(xì)胞膜之間即形成了穩(wěn)定的高阻封接。這時進(jìn)行快電容補(bǔ)償(C-fast),稍加負(fù)壓或電擊破膜,形成全細(xì)胞模式,后行慢電容補(bǔ)償(C-slow),并通過漏電流法減去漏電流(leak substraction)。在設(shè)定的刺激電壓模式下記錄引出的電流。全細(xì)胞膜片鉗記錄所用放大器為MultiClamp700B膜片鉗放大器(AXON,美國),使用Pclamp10.0軟件描記實(shí)驗(yàn)曲線和處理結(jié)果。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 以正常ACSF灌流所記錄到的數(shù)據(jù)為正常組,含尼可剎米的ACSF灌流記錄到的數(shù)據(jù)為尼可剎米組。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)和配對t檢驗(yàn),Origin7.5軟件作圖,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 尼可剎米對皮層神經(jīng)元電壓依賴性鈉電流的影響 鉗制膜電位于-80 mV,給予-80～+20 mV的階梯去極化脈沖步幅10 mV,步寬12 ms,記錄到電壓門控內(nèi)向電流。該電流在大約-50 mV時出現(xiàn)、-20mV時達(dá)到峰值,符合鈉通道的動力學(xué)特征,并可被外液中加入的1 μ mol/L TTX阻斷,確定所記錄到的是鈉電流。記錄到空白ACSF下的鈉電流后,經(jīng)蠕動泵灌流含5 mg/L尼可剎米的ACSF[4],10 min后再次記錄鈉電流。比較使用尼可剎米前后鈉電流的變化,分析尼可剎米對皮層神經(jīng)元鈉電流的作用。以測試電壓為橫軸、相應(yīng)電壓下鈉電流幅值為縱軸繪制出給藥前后I-V曲線,將各細(xì)胞給藥前后各測試電壓下最大激活電流進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),尼可剎米在膜電位-50～+20 mV范圍內(nèi)增大鈉電流。(n=10,單因素方差分析:F=195.458,P=0.000,圖1A尼可剎米對神經(jīng)元鈉電流原始圖,圖1B尼可剎米對神經(jīng)元鈉電流I-V曲線圖)。

圖1 尼可剎米對皮層神經(jīng)元鈉電流(圖1A)和鈉通道I-V曲線(圖1B)的作用。

2.2 尼可剎米對皮層神經(jīng)元電壓依賴性鈉通道激活曲線和失活曲線的影響

2.2.1 尼可剎米對皮層神經(jīng)元電壓依賴性鈉通道激活曲線的影響 鉗制膜電位于-70 mV,首先給予-130 mV、寬 500 ms的超極化脈沖,然后從-70 mV起給予10 mV步幅遞增、12 ms步寬的去極化脈沖刺激至0 mV,誘發(fā)鈉電流。以測試電壓為橫軸,測試電壓下的I/Imax為縱軸,用Boltzmann方程I/Imax=I/{1+exp〔(V-V1/2)/κ〕}進(jìn)行曲線擬合。其中 V1/2為半數(shù)激活電壓。繪制給藥前后的穩(wěn)態(tài)激活曲線。給藥前鈉通道激活曲線 V1/2為(-34.67±3.07)mV,給予尼可剎米后V1/2變?yōu)?-37.63±3.37)mV(n=10,P＜0.05)。激活曲線在尼可剎米加入后向超級化方向移動(圖2A),表明 5 μ g/mL的尼可剎米使鈉通道激活門開放閾值降低。

2.2.2 尼可剎米對皮層神經(jīng)元電壓依賴性鈉通道穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響 鉗制膜電位于-100 mV,給予-120～+10 mV、寬500 ms(足夠長的時間來獲得穩(wěn)態(tài)失活),階躍10 mV的系列條件脈沖刺激,條件脈沖后給予固定去極化至-20 mV、步寬12 ms的測試脈沖。以測試脈沖所激活的電流相對值I/Imax對條件脈沖電壓作圖,用Boltzmann方程I/Imax=I/{1+exp〔(V-V1/2)/κ〕}進(jìn)行曲線擬合,得出鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活曲線(圖2B)。給藥前鈉通道失活曲線V1/2為(-43.36±3.06)mV,給予尼可剎米后V1/2為(-33.24±2.05)mV(n=10,P＜0.01)。尼可剎米使鈉通道穩(wěn)態(tài)失活曲線向去極化方向移動,即鈉通道失活門關(guān)閉閾值升高。

圖2 尼可剎米對皮層神經(jīng)元鈉通道激活曲線(A)和失活曲線(B)的作用

3 討 論

尼可剎米在臨床上被應(yīng)用于以下3個方面:(1)呼吸中樞興奮劑[5],可選擇性興奮延髓呼吸中樞;(2)降低肝臟轉(zhuǎn)氨酶和黃疸,常用來治療新生兒黃疸[6-7];(3)作為溶解性較差藥物的促溶劑,促進(jìn)藥物的溶解和在體內(nèi)的吸收、釋放[8-9]。許多資料表明,鈉通道結(jié)構(gòu)和功能的改變與神經(jīng)元正常功能和多種疾病密切相關(guān)。鈉離子通道是神經(jīng)元電活動的基本通道,是產(chǎn)生動作電位和長時程增強(qiáng)(long term potentiation,LTP)的基礎(chǔ)。鈉電流幅度影響著神經(jīng)元的興奮性和動作電位幅度[10-11]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,尼可剎米使皮層神經(jīng)元鈉通道激活曲線向超極化方向移動,通道激活門開放閾值變負(fù),通道激活門易開放;通道失活曲線向去極化方向移動,通道失活門關(guān)閉電位升高,通道失活門不易關(guān)閉。尼可剎米通過改變鈉通道動力學(xué)特征增加了皮層神經(jīng)元鈉電流。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,尼可剎米對皮層神經(jīng)元有興奮作用,這可能是尼可剎米興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)(包括延髓呼吸中樞)的細(xì)胞機(jī)制之一。

Bushma等[12]發(fā)現(xiàn)尼可剎米用于降低肝臟轉(zhuǎn)氨酶時可增加還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、谷胱甘肽、尿苷二磷酸葡糖醛酸的生物轉(zhuǎn)化作用。尼可剎米進(jìn)入體內(nèi)后去乙基轉(zhuǎn)化為尼克酰胺,然后再被甲基化成為N-甲基尼克酰胺經(jīng)腎臟排出。維生素PP包括尼克酰胺和尼克酸兩種形式(兩種形式在體內(nèi)可以互相轉(zhuǎn)化),尼克酸、核酸、磷酸、腺嘌呤經(jīng)酶促反應(yīng)組成脫氫酶的輔酶NAD+和NADP+[13]。作者推測尼可剎米對海馬神經(jīng)元的作用通過經(jīng)典PKC途徑在NADPH位點(diǎn)存在交互作用。尼可剎米增加NADPH激活PKC、活性氧族(ROS)增加鈉電流,增加呼吸中樞神經(jīng)元興奮性來發(fā)揮呼吸興奮劑作用。臨床上過量使用尼可剎米引起中樞興奮、精神錯亂、惡心、嘔吐、抽搐、血壓升高、心律失常、驚厥等不良反應(yīng),這些癥狀與鈉通道不能正常關(guān)閉導(dǎo)致組織細(xì)胞興奮性增高的鈉通道變異疾病表現(xiàn)相似[14],也間接提示尼可剎米的作用與呼吸神經(jīng)元細(xì)胞膜鈉電流有關(guān),為作者的實(shí)驗(yàn)提供了佐證。Na+內(nèi)流被認(rèn)為是缺血性腦損害的始動因素之一。在缺血缺氧條件下神經(jīng)元能量代謝障礙、胞內(nèi)ATP減少使Na+-K+泵活性降低,膜靜息電位朝去極化方向變化。神經(jīng)元膜電位去極化促使鈉通道開放增加,進(jìn)一步增加胞內(nèi)鈉濃度。胞內(nèi)鈉濃度升高除了引起神經(jīng)元水腫外還直接或間接引起鈣超載和以一些興奮性遞質(zhì)釋放,從而加重神經(jīng)元的缺血缺氧性損傷。臨床上治療缺血性腦損傷常采用低溫、高壓氧、改善微循環(huán)、增加神經(jīng)元抗缺氧能力等措施。低溫降低神經(jīng)元代謝率、減少ATP的消耗,同時也降低了鈉通道活性,降低了細(xì)胞鈉濃度,有利于神經(jīng)元正常功能的恢復(fù)[15]。高壓氧治療提高了動脈血氧分壓,有利于神經(jīng)元攝取足夠的氧以恢復(fù)正常功能[16]。本實(shí)驗(yàn)從尼可剎米對鈉電流的作用方面,探討了尼可剎米興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制,根據(jù)尼可剎米對鈉電流的興奮作用為尼可剎米的臨床使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指導(dǎo)意見。

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Roles of nikethamide on sodium channel of cortical neurons in neonatal rat brain slice

QI AN Zhi-bin1,SONG Xiao-rong2,J I Ming-li2
(1.Department of Functional Lab;2.Department of Pathophysiology,Xinxiang Medical University,Xinxiang,Henan453003,China)

ObjectiveTo explore the effects of nikethamide on sodium channel in cortical neurons of brain slice in neonatal rat.MethodsUsing the whole-cell patch-clamp technique to record sodium currents of cortical neurons of brain slice in neonatal rat.ResultsThe tetrodotoxin-sensitive voltage-dependent sodium currents in cortical neurons were increased by nikethamide.After nikethamide application,a clear shift of the activation curve of Na+channel was shown towards more hyperpolarized potential,resulting in channel opening at more negative membrane potentials.In the presence of nikethamide,the voltage for half-activation(V1/2)was(-37.63±3.37)mV compared with the control of(-34.67±3.07)mV(n=10,P＜0.05).The curve of steadystate inactivation of Na+channel was shifted towards positive potential after treatment of nikethamide.In the presence of nikethamide,V1/2 was(-33.24±2.05)mV compared with the control of(-43.36±3.06)mV(n=10,P＜0.01).ConclusionNikethamide alters the sodium channel kinetics and increases the voltage-dependent sodium currents.This might be the reason that nikethamide increases the excitability of neurons.

nikethamide;cortical neuron;whole-cell patch-clamp;sodium channel

R971.7;R965

A

1671-8348(2010)09-1053-03

2009-08-17

2009-10-19)

?論 著?