劉永剛，華松，蘭杰，宋永利，何玉龍，權(quán)富生，張涌

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生殖和胚胎工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100

基因打靶定點(diǎn)突變秦川牛MSTN基因

劉永剛，華松，蘭杰，宋永利，何玉龍，權(quán)富生，張涌

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生殖和胚胎工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100

Myostatin (MSTN，肌肉生長抑制素) 基因?qū)儆赥GF-β超家族，對(duì)骨骼肌的生長發(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用。該基因的功能缺失，能夠引起肉用動(dòng)物的“雙肌”表型，從而提高產(chǎn)肉率。基因打靶技術(shù)是制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的常用方法。構(gòu)建了兩個(gè)置換型打靶載體pA2T-Mstn4.0和pA2T-Mstn3.2，通過同源重組將G938A突變點(diǎn)引入秦川牛MSTN基因第三外顯子。電穿孔方法轉(zhuǎn)染秦川牛胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)過600 μg/mL G418和50 nmol/L GCV的藥物正負(fù)篩選，共得到170個(gè)藥物抗性細(xì)胞克隆。對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行PCR、測(cè)序及Southern blotting 鑒定，結(jié)果顯示，第58號(hào)細(xì)胞克隆為發(fā)生了正確同源重組的中靶細(xì)胞。牛胎兒成纖維細(xì)胞中的MSTN基因的一條等位基因被成功改造。

肌肉生長抑制素，基因打靶，定點(diǎn)突變，成纖維細(xì)胞，秦川牛

秦川牛是中國著名的肉牛品種。提高產(chǎn)肉率是秦川牛良種選育工作的主要目標(biāo)之一。常規(guī)的選育方法存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的缺陷。本研究通過基因打靶技術(shù)，在秦川牛MSTN基因第三外顯子引入G938A點(diǎn)突變，改變?cè)摶虻纳飳W(xué)功能，并建立攜帶G938A突變點(diǎn)的秦川牛胎兒成纖維細(xì)胞株，為核移植方法批量生產(chǎn)“雙肌”秦川牛提供供體細(xì)胞，并為肉牛品種改良建立一套快速、有效的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

40日齡的秦川牛胎兒由楊凌科元克隆股份有限公司提供。質(zhì)粒 pA2T打靶骨架載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。LA Taq酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司。DNA凝膠回收試劑盒購自杭州博日公司。各種限制性內(nèi)切酶購自MBI公司。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑，包括DMEM/F12(GIBCO)、胎牛血清 (GIBCO)、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(GIBCO)、G418(GIBCO)、GCV(InvivoGen)。Southern 雜交Ⅱ型試劑盒 (Roche)。細(xì)胞基因組提取試劑盒購自天根公司。引物合成、基因測(cè)序工作及定點(diǎn)突變均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。電轉(zhuǎn)染儀ECM 2001購自BTX公司。

1.2 方法

1.2.1 打靶載體的構(gòu)建

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的通用型打靶載體 pA2T作為骨架載體。采取秦川牛血液，提取基因組并以此為模板，用 LA Taq酶擴(kuò)增同源臂。根據(jù)GenBank中公布的牛MSTN序列 (Accession No. AF320998)設(shè)計(jì)同源臂引物。同源長臂分別利用2對(duì)不同的引物 (C1s/C1a和C2s/C2a) 進(jìn)行擴(kuò)增，得到2條不同的同源長臂，以引物Ds/Da擴(kuò)增同源短臂。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，再通過PCR方法在長臂的上游和下游分別引入酶切位點(diǎn)Sgs I和Bsp1407 I；在短臂的上游和下游分別引入酶切位點(diǎn)Cla I和Spe I。將同源臂進(jìn)行TA克隆后，送公司測(cè)序，同時(shí)在短臂上完成G938A的定點(diǎn)突變。同源臂完成測(cè)后，用Sgs I和Bsp1407 I雙酶切長臂TA克隆，再以Spe I和Cla I雙酶切短臂TA克隆，回收同源臂，再用相同的酶分別雙酶切 pA2T之后與同源臂連接，構(gòu)建完成pA2T-Mstn4.0和pA2T-Mstn3.2打靶載體 (圖1)。經(jīng)過Sac II線性化之后，電轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞。

1.2.2 原代牛胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將懷孕40 d的牛胎兒無菌取出，去除頭部、內(nèi)臟及四肢，PBS洗數(shù)次，用剪刀將其剪碎，然后用0.25%的胰酶在37℃條件消化約 15 min[7]。將消化后的細(xì)胞懸液離心，去上清后，將細(xì)胞團(tuán)塊重懸在含有2 mmol/L 的L-谷氨酰胺、5 ng/mL bFGF、10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素的DMEM中，最后將細(xì)胞懸液移入60 cm培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天換液1次，在細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)將其凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 打靶載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞及細(xì)胞篩選

在60 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的胎兒成纖維細(xì)胞90%匯合時(shí)，消化懸浮細(xì)胞。吸取細(xì)胞懸液 (細(xì)胞數(shù)量約2×106)，離心后，用無血清培養(yǎng)液重懸，再次離心，棄上清。用電轉(zhuǎn)液懸浮細(xì)胞，加入10 μg 的線性化后的質(zhì)粒，混勻，4℃放置 10 min，轉(zhuǎn)移至0.4 cm電轉(zhuǎn)杯，在1250 V/cm，1 ms條件下，電穿孔3次。電擊完畢，在37℃放置10 min，接種在10 cm培養(yǎng)皿中，添加10 mL培養(yǎng)液。電轉(zhuǎn)染36 h后，換含有600 μg/mL G418進(jìn)行正篩選，待對(duì)照組細(xì)胞死完，在培養(yǎng)液中加入 50 nmol/L GCV進(jìn)行負(fù)篩選。每2~3 d更換1次培養(yǎng)液，大約篩選10~13 d后，可見有細(xì)胞克隆形成。將邊緣清晰、生長旺盛的細(xì)胞克隆用克隆環(huán)挑取后轉(zhuǎn)移至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞克隆長至80%~90%密度時(shí)，傳代接種24孔板中。細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增到一定數(shù)量，消化、分離出一半的細(xì)胞，提取基因組用于PCR鑒定，其余細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)胞單克隆的PCR鑒定及測(cè)序

根據(jù)牛 MSTN 基因序列 (Accession No. AF320998) 和Neo基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)鑒定引物：P1/P2和P3/P4，見表1。其中，P1、P2分別位于Neo兩側(cè)的同源臂上；P3位于 Neo表達(dá)框架內(nèi)；P4位于同源短臂的外側(cè) (圖2)。將P1/P2、P3/P4擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物純化后，送公司測(cè)序，以進(jìn)一步驗(yàn)證同源重組的發(fā)生。

圖1 打靶載體PA2T-Mstn構(gòu)建圖Fig. 1 Structure of targeting vector pA2T-Mstn.

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

圖2 牛MSTN基因打靶示意圖Fig. 2 Diagram of gene targeting in bovine MSTN.

1.2.5 中靶細(xì)胞克隆的Southern blotting鑒定

擴(kuò)增培養(yǎng)陽性單克隆細(xì)胞，提取基因組DNA。取約20 μg中靶細(xì)胞克隆的基因組DNA，經(jīng)Ac1 I酶切后，在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，分離條帶。通過向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將DNA轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上，80℃固定2 h。PCR擴(kuò)增同源短臂的其中一段作為模板制作探針，按照Southern雜交試劑盒說明書進(jìn)行雜交、免疫反應(yīng)和X光片曝光，最后得到X光片圖像。

1.2.6 中靶細(xì)胞中MSTN基因突變位點(diǎn)的測(cè)序檢測(cè)

以中靶細(xì)胞基因組為模板，在第三外顯子G938A突變位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物P5和P6，利用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化后送TaKaRa公司測(cè)序，驗(yàn)證打靶成功后基因組MSTN基因中G938A突變點(diǎn)是否存在。

2 結(jié)果

2.1 PA2TMSTN打靶載體的構(gòu)建

牛MSTN基因有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，同源長臂包括了外顯子 1和外顯子 2，短臂包括了外顯子3及G928A突變點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了2個(gè)置換型打靶載體pA2T-Mstn4.0和pA2T-Mstn3.2，線性化后分別為14.2 kb (圖3) 和13.3 kb (圖4) (載體構(gòu)建示意圖見圖 2)。這兩個(gè)載體使用了相同的同源短臂，其長臂長度分別為4.0 kb和3.2 kb，且選取部位不同。兩個(gè)同源臂的中間是Neo表達(dá)框，用于正篩選。在Neo表達(dá)框的兩側(cè)設(shè)計(jì)了Loxp序列，打靶成功后，可以通過傳染 Cre酶表達(dá)系統(tǒng)切去基因組中的Neo表達(dá)框，避免 Neo表達(dá)帶來的不良影響[8]。在兩個(gè)同源臂的外側(cè)各設(shè)計(jì)了一個(gè)tk基因，用于負(fù)篩選。通過電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞，發(fā)生正確的同源重組后，Neo代替MSTN基因第2內(nèi)含子區(qū)的部分序列，同源短臂與基因組中的同源序列發(fā)生交換，同時(shí)將G938A引入基因組中。

2.2 藥物抗性細(xì)胞的獲得及PCR檢測(cè)

將 SacⅡ線性化的打靶載體 pA2T-Mstn4.0和pA2T-Mstn3.2分別電轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞 (圖5A、5B)，經(jīng)過G418和GCV正負(fù)篩選，分別得到了60和110個(gè)具有藥物抗性的細(xì)胞克隆 (圖5C、5D)。細(xì)胞克隆經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)，提取部分細(xì)胞的基因組經(jīng)行PCR鑒定。先用P1/P2引物進(jìn)行PCR鑒定，以轉(zhuǎn)染pA2T-Mstn4.0載體的第58號(hào)細(xì)胞基因組為模板，PCR擴(kuò)增出兩條帶，一條2.5 kb片段，另一條3.6 kb片段 (圖6A)。再用P3/P4引物PCR鑒定58號(hào)細(xì)胞，擴(kuò)增出一條1.8 kb的帶 (圖6B)，其他細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)果為陰性。經(jīng)過兩對(duì)引物的PCR鑒定，確定pA2T-Mstn4.0轉(zhuǎn)染的58號(hào)細(xì)胞克隆為中靶細(xì)胞，結(jié)果說明MSTN基因的一條等位基因被打靶成功。將 PCR擴(kuò)增片段測(cè)序后，證實(shí)與預(yù)期的序列一致。

圖3 打靶載體PA2T-Mstn4.0的酶切鑒定圖Fig. 3 Identification of pA2T-Mstn4.0 vector by enzyme digestion. M: DNA marker D15000; 1: PA2T-Mstn4.0 digested with Sgs I and Bsp1407I.

圖4 打靶載體PA2T-Mstn3.2的酶切鑒定圖Fig. 4 Identification of pA2T-Mstn3.2 vector by enzyme digestion. M: DNA marker D15000; 1: pA2T-Mstn3.2 digested with Sgs I.

圖5 原代胎兒成纖維細(xì)胞及轉(zhuǎn)染PA2T-Mstn4.0載體后細(xì)胞Fig. 5 Cattle fetus fibroblast cells and cells transfected with pA2T-Mstn4.0. (A) Fetus fibroblast cells (40×). (B) Fetus fibroblast cells after transfection(40×). (C) Selection with G418+GCV after transfection (40×). (D) Selection with G418+GCV after transfection (100×).

2.3 中靶細(xì)胞克隆的Southern bloting鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證同源重組事件的發(fā)生，將陽性細(xì)胞克隆擴(kuò)增并提取基因組，進(jìn)行Southern雜交鑒定。通過 Acl I酶切細(xì)胞基因組，并提取未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組作為對(duì)照。打靶載體與 MSTN基因位點(diǎn)發(fā)生了同源重組，酶切并進(jìn)行凝膠電泳之后在MSTN基因位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生兩條帶，一條為中靶的等位基因7.4 kb，一條為野生型等位基因6.2 kb。而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組，經(jīng)酶切之后，只有一條6.2 kb的條帶 (圖7)。Southern 雜交結(jié)果證明所檢測(cè) 58號(hào)細(xì)胞克隆為發(fā)生正確同源重組的細(xì)胞克隆。

圖6 藥物抗性細(xì)胞PCR鑒定結(jié)果Fig. 6 PCR analysis of drug-resistant cell colonies. (A) PCR products of P1/P2. (B) PCR products of P3/P4. M: DNA marker Ⅲ.

圖7 中靶細(xì)胞克隆的Southern blotting鑒定圖Fig. 7 Southern blotting analysis of positive cell colony. WT: wild-type MSTN; No. 58 and No.59 are drug-resistant cell colony.

2.4 藥物抗性細(xì)胞中MSTN基因突變位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果

PCR鑒定陽性細(xì)胞基因組中G938A突變位點(diǎn)，所擴(kuò)增的PCR片段包括了突變位點(diǎn)G938A，測(cè)序結(jié)果證實(shí)中靶細(xì)胞MSTN基因中存在突變G938A (圖8、9)。

圖8 58號(hào)中靶細(xì)胞突變位點(diǎn)與野生型MSTN基因的對(duì)比Fig. 8 MSTN mutation in 58 cell line compared with wild-type normal cell.

圖9 58號(hào)中靶細(xì)胞基因組突變位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果Fig. 9 Sequencing result of G938A in the No.58 cell colony.

3 討論

MSTN基因通過調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化和自我更新來調(diào)控肌肉生長發(fā)育[9]。敲除小鼠的 MSTN基因，或者抑制該基因的功能后，肌肉增大了20%~ 30%[10-12]。通過基因打靶技術(shù)對(duì)家畜原有基因進(jìn)行改造、敲除或敲入新的基因，再結(jié)合體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在羊、豬和牛中都已有成功的先例[13-15]。本實(shí)驗(yàn)通過基因打靶定點(diǎn)突變了秦川牛MSTN基因，以期得到具有“雙肌”表型的秦川牛。在構(gòu)建打靶載體過程中，同源臂的選取部位及長度與打靶效率有一定的關(guān)系[16]，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了兩個(gè)打靶載體pA2T-Mstn4.0和pA2T-Mstn3.2，這兩個(gè)載體使用了相同的短臂，只是長臂的選取部位及長度不同。轉(zhuǎn)染pA2T-Mstn4.0，篩選得到60個(gè)具有藥物抗性細(xì)胞克隆，經(jīng)過PCR鑒定，確定了58號(hào)細(xì)胞克隆為中靶細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 pA2T-Mstn3.2，共得到了 110個(gè)細(xì)胞克隆，但是未鑒定出發(fā)生正確同源重組的細(xì)胞克隆，分析其原因可能是pA2T-Mstn3.2同源長臂較短，以至于發(fā)生同源重組的效率非常低；也可能是同源長臂的選取位點(diǎn)不易發(fā)生重組。

經(jīng)過 PCR檢測(cè)中靶細(xì)胞的基因型，結(jié)果證實(shí)MSTN基因的一條等位基因被打靶成功，說明該基因的兩條等位基因中只有一條被引入 G938A突變點(diǎn)，另一條為野生型，這就意味著基因的功能并沒有全部喪失。通過 Wheeler等的研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因雜合子牛 (只有一條等位基因被引入G938A突變點(diǎn)) 的表型介于野生型和純合子牛之間，與正常牛相比不僅產(chǎn)肉率提高了，而且肉的口味也有所提高[17]。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于失去功能的等位基因所產(chǎn)生的蛋白仍然可以結(jié)合特異性受體，對(duì)野生型蛋白起到競(jìng)爭(zhēng)抑制的作用[18]，結(jié)果使整個(gè)基因的功能受到抑制，并非完全喪失功能，其詳細(xì)機(jī)理需要進(jìn)一步驗(yàn)證。這種MSTN基因雜合子牛同純合子皮愛蒙特牛相比，盡管產(chǎn)肉率稍低，但是由于肌肉高度發(fā)達(dá)而引發(fā)的負(fù)面影響也顯著小于純合子牛。各種動(dòng)物是經(jīng)過長期進(jìn)化而來的，若完全改變動(dòng)物基因組中的某個(gè)基因功能很可能會(huì)引起難以預(yù)見的負(fù)面影響，因此，本實(shí)驗(yàn)通過MSTN基因一條等位基因的成功改造及陽性細(xì)胞的獲得，為實(shí)際生產(chǎn)中制作轉(zhuǎn)基因牛、加速肉牛的品種改良具有重要意義。

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Site-directed mutagenesis of MSTN gene by gene targeting in qinchuan cattle

Yonggang Liu, Song Hua, Jie Lan, Yongli Song, Yulong He, Fusheng Quan, and Yong Zhang
Key Laboratory of Animal Reproductive Endocrinology & Embryo Engineering, Ministry of Agriculture, College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling 712100, China

Myostatin, a member of the transforming growth factor β (TGF-β) family, is a negative regulator for muscle growth. Loss of the function of this gene is associated with the phenotype described as “double muscling”, an extreme form of muscle development characterized by a large increase in muscle mass. Two replacement vectors, pA2T-Mstn4.0 and pA2T-Mstn3.2, were constructed, linearized, and transfected into the bovine fetal fibroblasts through electroporation. 170 drug-resistant cell colonies were obtained in cell culture medium containing 600 μg/mL G418 and 50 nmol/L GCV. Targeted homologous integration occurred in colony No. 58 as identified by PCR, and the targeted colony was further confirmed by sequencing and Southern blotting. This suggested that one allele of myostatin was successfully mutagenized in bovine fetal fibroblasts.

myostatin, gene targeting, site-directed mutagenesis, bovine fetal fibroblasts, Qinchuan cattle

肌肉生長抑制素，又稱生長分化因子8(GDF-8)，屬于TGF-β超家族，其結(jié)構(gòu)具有TGF-β超家族的典型特征[1]。MSTN基因?qū)∪馍L發(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用，在調(diào)節(jié)肌肉生長發(fā)育過程中起主要作用，不僅抑制肌細(xì)胞的增殖，還抑制肌細(xì)胞的分化[2]。將小鼠MSTN 基因敲除之后，發(fā)現(xiàn)突變小鼠的體重比雜合體和野生型小鼠體重增加約30%，肌細(xì)胞增生和肌纖維肥大雙重作用所造成的肌肉肥大是造成體重增加的主要原因，并且這一表型與動(dòng)物的性別及年齡無關(guān)[1]。世界著名的具有“雙肌”表型的比利時(shí)蘭牛和皮埃蒙特牛在其MSTN基因的編碼區(qū)均存在突變。比利時(shí)蘭牛MSTN基因的第三外顯子缺失了11個(gè)核苷酸，而在皮愛蒙特牛的第三外顯子的一個(gè)核苷酸由鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰?(G938A)，導(dǎo)致第313個(gè)氨基酸由半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼醄3-4]。由于G938A點(diǎn)突變影響了蛋白質(zhì)水平二硫鍵的形成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而MSTN基因的生物學(xué)功能發(fā)生改變[5]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證G938A突變位點(diǎn)與肌肉表型的關(guān)系，Nishi等制作了G938A點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠表現(xiàn)出了類似于皮愛蒙特牛的肌肉表型[6]，證實(shí)了G938A是導(dǎo)致MSTN基因功能缺失，并表現(xiàn)“雙肌”表型的關(guān)鍵突變點(diǎn)。

November 26, 2009; Accepted: January 27, 2010

Supported by:Program for Disease-resistant Transgenic Cattle (No. 2008ZX08007-004).

Yong Zhang. Tel: +86-29-87080085; E-mail: zhy1956@263.net

抗病轉(zhuǎn)基因牛新品種培育項(xiàng)目 (No. 2008ZX08007-004) 資助。