張榮娟,于穎彥

(上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院,上海消化外科研究所,上海200025)

癌相關基因主要包括兩大類,即原癌基因與抑癌基因。在自然或實驗條件下原癌基因的活化或者抑癌基因的失活具有誘導細胞惡性轉化功能。癌相關基因的表達調控異常是細胞癌變中的重要事件。在癌相關基因轉錄調控中,轉錄調控蛋白作為反式作用因子(trans acting factors)與基因自身的順勢作用元件(cis acting elements)相互作用,實現(xiàn)對基因轉錄水平的調控。故深入研究癌相關基因的反式作用因子,有助于我們解析癌相關基因的表達調控機制,從而為以基因干預為目的的靶向治療提供有價值的理論依據(jù)。

1 酵母單雜交法

酵母單雜交法(Yeast one hybrid,Y1H)是研究DNA與蛋白質相互作用的一種方法,它借助于酵母細胞內的報告基因表達分析,識別與DNA相結合的蛋白。同時,由于酵母屬于真核細胞,利用該系統(tǒng)獲得的基因表達調控蛋白可以較好的體現(xiàn)真核細胞基因表達調控的真實狀況。真核細胞基因表達受轉錄因子的調控,轉錄因子具備與DNA相結合的結合域(Binding domain,BD)和轉錄激活結構域(Active domain,AD)。酵母單雜交的主要原理是:酵母細胞內的GAL4蛋白是一種典型的轉錄因子,GAL4有DNA結合域和激活酵母半乳糖苷酶的上游激活結構域,而激活結構域又可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用,從而增強RNA聚合酶的轉錄促進活性。研究人員需要將含有目的基因轉錄調控區(qū)DNA的報告質粒整合到酵母基因組,產生帶有目的基因的酵母報告株;然后將酵母轉錄因子GAL4的DNA結合域置換為cDNA文庫編碼基因,只要文庫編碼基因表達的蛋白能與目的基因DNA轉錄調控區(qū)相互作用,便可通過轉錄激活結構域激活RNA聚合酶,啟動酵母細胞內報告基因的轉錄(圖略),使該報告酵母株在選擇性培養(yǎng)基內得以存活。利用Y1H系統(tǒng)檢測到的DNA結合蛋白質是處于自然構象,克服了體外研究時蛋白質通常處于非自然構象的缺點。但該方法也存在插入的靶基因可能會與酵母內源性轉錄激活因子相互作用的假陽性結果,或者酵母表達的轉錄激活域融合蛋白(Gal4AD)在酵母內不能穩(wěn)定地表達或發(fā)生錯誤折疊等假陰性結果。Y1H技術主要用于釣取已知基因的轉錄調控蛋白,或者鑒定DNA結合蛋白的DNA結合域。Yang等利用酵母單雜交在人乳腺組織cDNA表達文庫成功篩選到四個孤兒核受體,發(fā)現(xiàn)該類受體在調控人乳腺組織芳香酶的表達中發(fā)揮重要作用[1]。NGAL(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因是食管癌相關新基因,以該基因的NF-kappa B元件核心序列作為誘餌,在人食管癌細胞系SHEEC的酵母雜交cDNA文庫中釣取到5類DNA結合蛋白,為探討NGAL基因表達調控機制奠定了基礎[2]。已有多個研究小組通過酵母單雜交技術篩選到DNA結合蛋白[3,4]。

2 噬菌體展示技術

噬茵體展示技術(Phage display)于1989年由Winter和Lernerd研究組創(chuàng)立。最初主要用于抗體篩選,但亦可以用來鑒定蛋白質-DNA相互結合。噬茵體展示技術的原理是:將外源DNA片段插入合適的噬菌體外殼蛋白基因,由噬菌體表達被修飾后的融合蛋白,但不影響和干擾噬菌體的生活周期,同時可保持外源基因表達蛋白的天然構象。成軍課題組應用噬菌體展示技術在人肝細胞cDNA文庫中篩選到與cyclin B2和iNOS基因啟動子相結合的蛋白,揭示了上述基因的轉錄調控機制[5,6]。以上研究的成功經驗為癌相關基因DNA結合蛋白的篩選提供了可借鑒經驗。

3 生物信息學分析

生物信息學(Bioinformatics)是通過TRANSFAC或Mat-Inspector等軟件平臺對基因轉錄調控序列進行分析,預測可能的DNA結合蛋白。具體作法是:輸入靶基因以及轉錄起始點上游足夠長序列(一般需要超過2 000 bp),遞交數(shù)據(jù)庫后系統(tǒng)會輸出一系列信息,如啟動子域、轉錄起始點、相匹配的轉錄因子結合域、基因多態(tài)性(SNP)等,還可與PubMed鏈接查看相關研究發(fā)表。但該方法只能提供已知蛋白質的信息,無法發(fā)現(xiàn)全新的、蛋白質數(shù)據(jù)庫內不存在的DNA結合蛋白質。Palumbo等利用Mat-Inspector平臺篩選到MA2、RXR、PU.1以及VDR等轉錄因子在c-myb GGA重復區(qū)域的多個結合位點,并在EMSA和DNAaseⅠ足跡分析中得到驗證[7]。Li等利用Mat-Inspector平臺發(fā)現(xiàn)位于SPARC第三內含子的SATB1結合位點,并利用ChIP實驗得到證實[8]。

4 mRNA展示技術

mRNA展示技術(mRNA display)又稱為mRNA-蛋白質融合體展示技術,它是一種新型的、不依賴于細胞轉染的體外展示技術(In vitro display),該技術使得基因文庫容量及篩選效率都獲得大幅度提高。目前已成為可用于分離具有特定化學或生化特性的多肽和蛋白質的最佳方法之一。mRNA展示技術的原理是:化學合成興趣蛋白或小肽段的DNA文庫,并在DNA的5'端添加T7 RNA聚合酶啟動子、翻譯增強子和翻譯起始密碼子等序列,在3'端添加親和純化標簽。在體外利用T7 RNA聚合酶將DNA轉錄成RNA,把RNA的3'端和嘌呤霉素連接子結合,帶有嘌呤霉素連接子的誘餌RNA和RNA文庫在無細胞系翻譯體系中共翻譯,mRNA與其所翻譯的蛋白質結合起來形成mRNA-蛋白質融合體,再利用翻譯蛋白所帶的親和標簽,用親和層析技術將mRNA-蛋白質融合體純化出來,并對mRNA進行反轉錄,生成cDNA-mRNA-蛋白質融合體。采用ELISA,磁珠法等將篩選的靶物質固定于固相載體上,含有獵物蛋白的cDNA-mRNA-蛋白質融合體通過與固相載體上的靶物質特異性結合而得到分離,通過洗脫液將獵物cDNA-mRNA-蛋白質融合體洗脫下來,加酶分解得到cDNA,將其進行數(shù)輪PCR,富集和分離獵物蛋白質。日本學者Yanagawa等利用TPA反應元件為誘餌在基因文庫中篩選到多個DNA結合蛋白異二聚體復合物如 c-jun、c-fos、junD、junB、atf2、b-atf,表明 mRNA展示技術可以在一個實驗中鑒定多個DNA結合蛋白復合物[9]。

5 凝膠遷移率分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)

EMSA是一種可定性和定量鑒定蛋白質與特定核酸序列的結合的技術,目前已成為轉錄因子研究的經典方法。其基本原理是:將蛋白質與末端標記的核酸探針結合,通過電泳凝膠時,這種與蛋白質結合的復合物比未與蛋白結合的探針相比,其在凝膠中的泳動速度減慢,即表現(xiàn)為遷移速度相對滯后。還可通過加入特異性的抗體來檢測特定的蛋白質,從而驗證結合的特異性。其缺點是由于許多轉錄調控蛋白有相似或相同的DNA結合位點,故這種體外分析獲取的結果不一定能真實反映體內轉錄調控蛋白和DNA的結合狀況。姜安麗等對NKX 3.1基因上游的30bp序列進行EMSA分析,在不同腫瘤細胞株核蛋白提取物檢測到轉錄調控蛋白質,初步揭示了不同腫瘤細胞系中有不同的結合蛋白,提示了不同腫瘤之間基因調控機理的差異[10]。Wu等通過EMSA和ChIP分析,研究了Vimentin不同順式元件的調控蛋白質,揭示了它們在腫瘤發(fā)展過程中的意義[11]。Park等通過EMSA技術揭示了ERT與TGF-βRⅡmRNA表達沈默的機制[12]。Gorshkova等應用EMSA技術識別了GATA-6與NF-Y聯(lián)合調控K-ras在肺癌發(fā)生中的作用[13]。

6 染色質免疫共沉淀(Chromatin immunopricipitation,ChIP)

ChIP是鑒定與特定蛋白結合的基因序列或者鑒定與特定基因區(qū)域結合的蛋白質的有效方法。包括由核酸酶消化的非變性染色質免疫共沉淀(NChIP)和甲醛或UV光交聯(lián)的變性染色質免疫共沉淀(XChIP)兩種手段。NChIP采用未變性的染色質進行實驗,利用內切核酸酶消化細胞核裂解液,使染色質成碎片,利用單克隆抗體將結合有某蛋白質的染色質片段選擇性的進行免疫沉淀,再利用PCR方法進行DNA擴增及序列分析。該技術主要用于與DNA高親和力的組蛋白及其修飾體研究,如組蛋白甲基化、乙?；揎椃治?。XChIP則先將染色質進行變性處理,如向細胞核裂解液加入甲醛,或者利用UV輻射(260nm)以及紫外線照射[14],使DNA與蛋白質發(fā)生交聯(lián),然后利用超聲波將染色質破碎成小片段,再用特異性抗體將蛋白質-DNA復合物進行免疫共沉淀,最后逆轉交聯(lián)后分析沉淀的 DNA。ChIP的缺點是需要細胞數(shù)量大,限制了其在稀有細胞樣本如干細胞或組織活檢樣本研究中的應用?；谛酒娜旧|免疫共沉淀(ChIP on-chip)技術是鑒定全基因組范圍內蛋白結合位點,在整體水平識別某轉錄因子的靶基因方法。Hatzis等利用ChIP-on chip分析了TCF4(Wnt信號通路轉錄因子)在全基因組的染色質結合情況,并通過模序識別算法(motif discovery algorithms)揭示出TCF4結合位點為進化上保守的A-C/G-A/T-T-C-A-A-A-G模序[15]。

7 DNA足跡分析(DNA footprinting analysis)

DNA足跡分析是一種可以精確檢測蛋白質在DNA上的結合位點的實驗方法,有DNA酶Ⅰ足跡分析和硫酸二甲酯足跡分析兩種,其中以DNA酶Ⅰ足跡分析常用。其基本原理是:DNaseⅠ可以隨機水解核苷酸序列中的磷酸二酯鍵,將DNA切成單核苷酸;而結合有蛋白質的DNA則可免于被DNaseⅠ水解,在變性凝膠電泳的放射自顯影圖片上,相當于蛋白質結合部位會出現(xiàn)一空白區(qū)域,與對照組核苷酸序列條帶區(qū)相比較,此空白區(qū)恰似一足跡占據(jù)了部分核苷酸序列位置。通過與對照組的核苷酸電泳條帶對比,可以精確讀出與該蛋白質結合位點的核苷酸序列[16]。Li等利用EMSA和DNA酶Ⅰ足跡法分析了消化道腫瘤AFP基因的轉錄調控蛋白,在啟動子與增強子區(qū)鑒定出七個C/EBP結合位點,提出了C/EBP調節(jié)AFP基因表達的直接證據(jù)[17]。

8 紫外交聯(lián)分析DNA與蛋白質相互作用(Protein DNA interaction by UV crosslinking)

該方法原理是:經UV輻射的DNA可把轉錄調控蛋白與其順式元件以共價鍵方式連接,從而選擇性地標記與DNA特異性結合的DNA結合蛋白,以這種方式標記的轉錄因子能在變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的放射自顯影下顯示DNA結合蛋白的對應位點。該方法在定量蛋白質研究中具優(yōu)勢,它可以依靠變性膠將交聯(lián)的DNA結合蛋白分離開來,從而直接測定相互作用蛋白的分子量以及結合的蛋白總量,還可檢測到在EMSA中所看不到的微量蛋白。這為測定蛋白質與DNA的親和力及調控基因表達的能力提供了重要方法[18]。

9 DNA結合蛋白質對靶基因的功能調控研究

將DNA結合蛋白表達載體與啟動子報告基因載體共同轉染細胞模型,通過細胞內熒光素酶報告基因的表達強度來鑒定該DNA結合蛋白對啟動子的調控作用。利用siRNA下調DNA結合蛋白的表達或過表達DNA結合蛋白來驗證與報告基因轉錄水平的關系。該方法優(yōu)點在于靈敏度高且速度快;但也可因轉染效率不高或不能收集長期的實驗數(shù)據(jù)而受到限制。已有多個研究小組利用酵母單雜交技術篩選出與啟動子DNA結合的蛋白,并通過瞬時共轉染、siRNA干擾等手段進行了反式作用因子對啟動子表達的功能分析[19,20]。

綜上所述,DNA結合蛋白在癌相關基因的表達調控中發(fā)揮著重要作用。DNA結合蛋白與蛋白之間、DNA結合蛋白與靶基因之間的相互作用決定了靶基因的表達。掌握以上DNA結合蛋白的識別方法,將為腫瘤相關基因的功能研究提供重要的技術支撐。

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