徐 楓 王建中 張利能

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院耳鼻喉科,上海 200032;2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)和分子生物學(xué)系,上海 200032)

變應(yīng)原檢查對(duì)變應(yīng)性鼻炎診斷和治療有很重要的意義。現(xiàn)在有多種變應(yīng)原檢查方法,體內(nèi)檢查有皮內(nèi)試驗(yàn)、點(diǎn)刺試驗(yàn)[1]、斑貼試驗(yàn)和激發(fā)試驗(yàn)[2]等;體外實(shí)驗(yàn)包括嗜堿粒細(xì)胞組胺釋放實(shí)驗(yàn)、放射變應(yīng)原吸附實(shí)驗(yàn)[3],UniCap[4]和酶免實(shí)驗(yàn)[5]等。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測(cè)IgE、IgG,可以達(dá)到半定量的要求,是一種比較經(jīng)濟(jì)、簡便的檢測(cè)方法。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 粉塵螨過敏患者血清 26例變應(yīng)性鼻炎患者接受常見變應(yīng)原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn),其中粉塵螨點(diǎn)刺反應(yīng)陽性患者24例,粉塵螨反應(yīng)陰性患者2例。抽取5 mL靜脈血,分離血清,-80℃保存。Der f2特異性IgE陽性血清盤(panel)來自于美國PlasmaL-ab International和 Greer Laboratories,Inc.公司 。

1.1.2 臨床點(diǎn)刺試驗(yàn)材料 粉塵螨變應(yīng)原點(diǎn)刺液、點(diǎn)刺針為Allergopharma產(chǎn)品。

1.1.3 BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒 購自Pierce公司。

1.1.4 粉塵螨蛋白 原核表達(dá)純化的野生型Der f2。

1.1.5 ELISA試劑及材料 包被試劑:0.05 mol?L-1碳酸鹽緩沖液(pH 9.0)。洗滌液:1×PBS,加入Tween-20至0.02%濃度。封閉液:以洗滌液配制成含3%BSA的溶液。HRP標(biāo)記的抗人IgE抗體、TMB底物溶液和2N H2 SO4終止液購自KPL公司。96孔酶標(biāo)板購自Nunc公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Der f2原核表達(dá)及純化 依據(jù)粉塵螨變應(yīng)原蛋白質(zhì)第2組分序列設(shè)計(jì)引物。上下游引物序列分別加入 Eco R I和 Bam HⅠ位點(diǎn),以利于與pBV220載體連接。以粉塵螨變應(yīng)原蛋白質(zhì)第2組分cDNA為模板,以PCR方法擴(kuò)增編碼序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,切取特異性PCR條帶所在的膠條,按照膠回收試劑盒提取PCR產(chǎn)物。將膠回收的PCR產(chǎn)物與 T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,通過藍(lán)白斑篩選,挑取白色菌落搖菌,質(zhì)粒小抽,以Eco RI+Bam H I雙酶切重組T載體,將Der f2 DNA片段與p BV220質(zhì)粒連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH 5α,轉(zhuǎn)化菌送檢測(cè)序。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌誘導(dǎo)表達(dá)。

工程菌母液按1%體積比接種于2×YT培養(yǎng)液中,培養(yǎng)至OD600=0.8,再誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。菌體沉淀重懸于50 mL細(xì)菌裂解液中;超聲破菌后,4℃12 000 r?min-1離心30 min,棄上清液。包涵體沉淀洗滌后,以變性液溶解包涵體沉淀。采用Amersham FPLC系統(tǒng),在線對(duì)Der f2進(jìn)行純化、復(fù)性。A280檢測(cè)收集蛋白峰,每管 1 mL。經(jīng) Tricine-SDS-PAGE銀染后觀察,合并Der f2蛋白峰。

1.2.2 皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn) 按照Allergopharma試劑盒說明書操作規(guī)范,在每例患者前臂點(diǎn)刺常見變應(yīng)原,同時(shí)點(diǎn)刺組胺和0.9%氯化鈉溶液,分別作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。點(diǎn)刺后20 min觀察反應(yīng),以皮丘直徑大于組胺點(diǎn)刺皮丘直徑判定為陽性。

1.2.3 ELISA包被 蛋白質(zhì)以包被液稀釋成60 ng?mL-1的濃度,每孔加入100μL,4℃包被過夜。以洗滌液洗滌3次,每次5 min。封閉:每孔加300 μL封閉液,4℃封閉過夜。反應(yīng):每孔加入100μL血清或5倍稀釋的血清,37℃反應(yīng)2 h。以洗滌液洗滌4次,每次5 min。HRP標(biāo)記的抗抗體反應(yīng):每孔加入 100μL 1∶3 000稀釋的 HRP-anti-human IgE,37℃反應(yīng) 2 h。以洗滌液洗滌4次,每次 5 min。底物呈色:每孔加入100μL底物液,37℃反應(yīng)15 min后,加入100μL終止液。讀數(shù):以570 nm和450 nm波長讀取OD 570-OD450值。

2 結(jié) 果

2.1 pBV220-wt Der f2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將wt Der f2和mu Der f2分別插入載體pBV220,構(gòu)建成pBV220-wt Der f2和 pBV 220-mu Der f2重組質(zhì)粒。以EcoR I和BamHⅠ酶切產(chǎn)生與Der f2基因大小一致的片段。過 DNA測(cè)序驗(yàn)證,結(jié)果表明DNA序列與NCBI的序列一致。

2.2 粉塵螨Der f2重組蛋白的表達(dá)純化 wt Der f2蛋白在42℃誘導(dǎo)條件下形成了包涵體。菌體經(jīng)超聲破碎后,充分洗滌包涵體以除去可溶性蛋白以及膜蛋白。將包涵體溶于變性液中,進(jìn)行Sephacryl S-100HR柱層析分離及復(fù)性,通過分子篩除去包涵體中的雜蛋白,同時(shí)w t Der f2蛋白通過填料介質(zhì)的不斷吸附-解離而正確折疊,從而得到復(fù)性的wt Der f2蛋白(圖1)。

2.3 檢測(cè)方法的線性范圍和靈敏度 用PlasmaLab粉塵螨Derf2變應(yīng)原特異性IgE標(biāo)準(zhǔn)血清(1.66 U?mL-1～100 U?mL-1),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。對(duì)測(cè)得的OD值和Der f2特異性IgE濃度作回歸分析,回歸系數(shù)R2值為0.996。按照ELISA靈敏度計(jì)算方法[6],對(duì)0 U?mL-1標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行10次測(cè)試,求得零劑量點(diǎn)光密度均值(ˉx)和標(biāo)準(zhǔn)差(s),將ˉx+2s值插值運(yùn)算,得到靈敏度值為0.73 U?mL-1。

2.4 臨床血清樣品的檢測(cè) 在26例變應(yīng)性鼻炎患者中24例粉塵螨點(diǎn)刺反應(yīng)呈現(xiàn)陽性,2例的點(diǎn)刺反應(yīng)陰性。以野生型Der f2為包被材料的ELISA試劑盒,分析24例點(diǎn)刺反應(yīng)陽性的患者血清中Der f2特異性IgE的濃度,按照國際sIgE分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為陽性和陰性[4],結(jié)果22例陽性,陽性率為91.7%。

3 討 論

變應(yīng)性鼻炎的實(shí)驗(yàn)診斷包括體內(nèi)和體外方法,但體內(nèi)方法無法進(jìn)行定量分析。在體外方法的變應(yīng)原特異性IgE檢測(cè)試劑中,Pharmacia UniCap特異性IgE檢測(cè)系統(tǒng)具有較好的檢測(cè)效率。Pharmacia UniCap的優(yōu)點(diǎn)是,采用結(jié)合大量變應(yīng)原的高分子化合物固相,具有較高的靈敏度,特別是多種變應(yīng)原共同偶聯(lián)于同一固相,對(duì)于變應(yīng)原的篩查具有其它試劑所沒有的靈敏性。我們根據(jù)經(jīng)典的間接ELISA原理設(shè)計(jì)的Der f2特異性IgE檢測(cè)試劑,可定量分析血清中Der f2特異性IgE,其靈敏度等指標(biāo)與商業(yè)試劑具有平行性。已符合ng級(jí)分析要求,達(dá)到了國際sIgE分級(jí)中判斷陽性和陰性的截點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)。

由于ELISA微孔包被有足夠量純化的變應(yīng)原蛋白質(zhì),因此在針對(duì)性檢查患者血清中某一特定變應(yīng)原IgE時(shí),ELISA同樣具有與Pharmacia UniCap相當(dāng)?shù)撵`敏性?；谶@種考慮,研究設(shè)計(jì)了Der f2特異性IgEELISA檢測(cè)試劑。事實(shí)上,ELISA方法具備相當(dāng)高的測(cè)試效率,廣泛用于患者血清中抗原或抗體的分析。通過標(biāo)記信號(hào)放大系統(tǒng)的改進(jìn),ELISA可以應(yīng)用于皮克(pg,10-12g)級(jí)IgE定量分析。

目前,變應(yīng)原篩查和定量分析試劑系統(tǒng)采用世界衛(wèi)生組織國際IgE參考標(biāo)準(zhǔn)品(75/502),這有助于提高通過不同方法獲得的總IgE和特異性IgE結(jié)果的平行性,本研究檢測(cè)試劑也采用同樣的標(biāo)準(zhǔn)。由于不同試劑系統(tǒng)中固相包被的變應(yīng)原蛋白質(zhì)不同,常缺乏標(biāo)準(zhǔn)化。本研究檢測(cè)試劑中固相包被的變應(yīng)原蛋白是純化的Der f2,重組表達(dá)的變應(yīng)原蛋白質(zhì)可以很好地解決固相包被的變應(yīng)原蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化問題,此點(diǎn)是對(duì)包括UniCap等試劑系統(tǒng)的一個(gè)改進(jìn)。

本研究設(shè)計(jì)的sIgE ELISA實(shí)驗(yàn)可為螨類變應(yīng)原引起的持續(xù)性變應(yīng)性鼻炎提供輔助診斷依據(jù)。若用HRP標(biāo)記的抗IgG抗體代替本檢測(cè)試劑中H RP標(biāo)記的抗IgE二抗,則sIgG ELISA可用于檢測(cè)螨類特異免疫治療過程中機(jī)體產(chǎn)生的特定亞型IgG的濃度。雖然已有人開始以變應(yīng)原蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)來篩查患者敏感的變應(yīng)原[7],但在常年性變應(yīng)性鼻炎變應(yīng)原比較固定的情況下,本研究設(shè)計(jì)的變應(yīng)原特異性IgE ELISA方法依然有利于明確診斷,同時(shí),可以進(jìn)一步檢測(cè)特異性免疫治療效果。

1 徐慧珍,徐林根,姜 輝,等.變應(yīng)原皮膚點(diǎn)剌試驗(yàn)在變應(yīng)性鼻炎中的臨床意義[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2004,11(3):435-436.

2 Kanthawatana S,Maturim W,Fooanan S,et al.Skin prick reaction and nasal provocation response in diagnosisof nasal allergy to the house dust mite[J].Ann Allergy Asthma Immunol,1997,79(5):427-430.

3 Price JA,Reiser J,Longbottom JL,et al.Inhalant allergy in asthmatic child ren:skin prick test,radioallergosorbent test and chemiluminescent assay compared with allergen levels in their mattress dusts[J].International archives of allergy and applied immunology,1989,88(1-2):183-184.

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5 徐 楓,王建中,黃鳳娥,等.間接ELISA法對(duì)常年性變應(yīng)性鼻炎患者血清中屋塵螨變應(yīng)原特異性IgE的分析[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2005,12(6):1086-1088.

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7 Kim TE,Park SW,Cho NY,et al.Quantitative measurement of serum allergen-specific IgE on p rotein chip[J].Experimental&molecular medicine,2002,34(2):152-158.