朱華旭， 潘林梅， 李 歡， 唐于平

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥復(fù)方分離工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210029)

中藥(含復(fù)方，下同)由植物、動(dòng)物和礦物等天然產(chǎn)物構(gòu)成，其藥效物質(zhì)的獲取，不可避免的需要“去偽存真，去粗取精”，因而“分離”是中醫(yī)藥領(lǐng)域的共性關(guān)鍵技術(shù)［1］。中藥提取分離也是中成藥生產(chǎn)過(guò)程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，制藥工藝、技術(shù)的不同能引起成分組合的變化，成分組合的變化可以導(dǎo)致藥效的顯著變化，它直接影響到產(chǎn)品的質(zhì)量和臨床療效［2］。

黃連解毒湯源于《外臺(tái)秘要》，由黃連、黃柏、黃芩、梔子組成，具有清熱、瀉火、解毒的功效［3］。黃連解毒湯的傳統(tǒng)服用方法是湯劑入藥。上世紀(jì)90年代，日本學(xué)者在應(yīng)用黃連解毒湯治療腦中風(fēng)的研究中發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯提取物用于腦中風(fēng)后遺癥和腦血管性癡呆癥，其效優(yōu)于苯噻嗪酸鈣而無(wú)任何副作用;該提取物(エキス)是一種日本漢方制劑，制備方法是利用現(xiàn)代生產(chǎn)技術(shù)，模擬傳統(tǒng)的中藥煎煮方法，將中藥的煎取成分制成固體劑型;這一成果得到日本醫(yī)學(xué)界的確認(rèn)［4］。近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者對(duì)其改善腦缺血、益智作用的有效部位進(jìn)行了探索性的研究，研究表明，該方治療腦部疾病的有效部位為復(fù)方中的水溶性成分，包括小檗堿、黃芩苷和梔子苷等［5］。基于上述研究成果，本論文對(duì)全方水提取最優(yōu)工藝進(jìn)行探討，并對(duì)君臣藥組合、君佐藥組合、君使藥組合、君臣佐藥組合、君佐使藥組合水提取工藝中指標(biāo)性成分進(jìn)行檢測(cè)，旨在通過(guò)闡明復(fù)方配伍對(duì)君藥中指標(biāo)性成分的影響，建立可體現(xiàn)該方治療特點(diǎn)的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，為該方的新藥創(chuàng)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1100液相色譜(Agilent 1100四元泵;DAD檢測(cè)器;自動(dòng)進(jìn)樣器;Agilent 1100 LC色譜工作站)，江蘇漢邦科技有限公司生產(chǎn)Kromasil C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，Shimadzu Libror AEL－40SM電子天平。

藥材均購(gòu)自南京市藥材公司，經(jīng)本校生藥教研室王春根教授鑒定。黃連、黃芩、黃柏、梔子批號(hào)分別為050926、051015、050926、041106。對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品與生物制品檢定所，小檗堿批號(hào)為110713－200208(供含量測(cè)定用)，巴馬汀批號(hào)為0732－200005(供含量測(cè)定用)，藥根堿批號(hào)為0733－200005(供含量測(cè)定用)，黃芩苷批號(hào)為 110715－200212(供含量測(cè)定用)，梔子苷批號(hào)為110749－200511(供含量測(cè)定用)。乙腈、甲醇均為色譜純(江蘇漢邦公司)，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃連解毒湯全方水提取工藝的研究

黃連、黃柏、黃芩、梔子全方藥材按6∶4∶4∶6比例取9份，每份200 g，采用L9(34)正交試驗(yàn)法，分別以加水量(12倍、15 倍、18 倍)、提取時(shí)間(2 h、3 h、4 h)、提取次數(shù)(1 次、2次、3次)為正交因素，確定復(fù)方最佳水提工藝條件。測(cè)定各指標(biāo)性成分生物堿(小檗堿、巴馬汀、藥根堿)、黃酮苷、梔子苷的轉(zhuǎn)移率，確定全方提取物中各指標(biāo)性成分的含量。

2.2 黃連解毒湯組方－配伍水提取工藝的研究

根據(jù)數(shù)學(xué)組合原理，君藥黃連與臣、佐、使三味藥組成5個(gè)組合，分別為:黃連+黃芩(君臣藥組合)、黃連+黃柏(君佐藥組合)、黃連+梔子(君使藥組合)、黃連+黃柏+黃芩(君臣佐藥組合)、黃連+黃柏+梔子(君佐使藥組合)，藥材按原方比例取樣200 g，以全方的最佳水煎煮工藝提取各組藥物組合，測(cè)定各指標(biāo)性成分生物堿(小檗堿、巴馬汀、藥根堿)和黃酮苷或梔子苷的轉(zhuǎn)移率，比較不同組合中各指標(biāo)性成分的含量。

2.3 各指標(biāo)性成分的檢測(cè)方法

采用HPLC色譜法檢測(cè)各指標(biāo)性成分的含量。色譜條件:柱溫30℃;流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm、265 nm、280 nm;流動(dòng)相為梯度洗脫［6］，A相為乙腈，B相為0.5%三乙胺(磷酸調(diào)pH3.1)，梯度為0～20 min 5%A～15%A，20～40 min 15%A～20%A，40～50 min 20%A ～30%A，50～55 min 30%A～5%A。色譜圖見(jiàn)圖1～3。

圖1 生物堿HPLC圖譜

圖2 梔子苷HPLC圖譜

圖3 黃芩苷HPLC圖譜

2.4 樣品溶液的制備

取各組號(hào)煎煮液100 mL，干燥至衡重，測(cè)定固含量。取各組上述已測(cè)定固含的干燥物各0.1 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加35 mL的50%ACN，超聲30 min(功率250 W，頻率50 Hz)，放冷至室溫，加50%ACN定容至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得［7］。

2.5 藥材樣品制備與含量測(cè)定

按照2005年版《中國(guó)藥典》進(jìn)行樣品制備與含量測(cè)定［8］。

3 結(jié)果

3.1 黃連解毒湯全方水提取最佳工藝

采用L9(34)正交試驗(yàn)法，進(jìn)行了9次試驗(yàn)，見(jiàn)表1。以生物堿(小檗堿、巴馬汀、藥根堿三者之和的平均值)、黃酮苷、梔子苷轉(zhuǎn)移率進(jìn)行考察，確定提取的最佳工藝。

表1 正交設(shè)計(jì)表

按照2.4項(xiàng)法制備正交實(shí)驗(yàn)所對(duì)應(yīng)的各樣品溶液1～9，按照2.3項(xiàng)檢測(cè)樣品1～9中上述5種指標(biāo)性成分的含量，計(jì)算各成分相對(duì)藥材的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表2、3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表3的方差分析表可以看出，三因素對(duì)水煎煮工藝均無(wú)顯著性影響;由表2的簡(jiǎn)單計(jì)算可以看出，K3a＞K2a＞K1a，故因素A選擇水平3，即加18倍量;K3b＞K2b＞K1b，且K2b與K1b差值遠(yuǎn)大于K3b與K2b差值，原則上可選擇水平2～3之間的任一點(diǎn)，但從節(jié)約能源的角度考慮，因素B選擇水平2，即煎煮3 h;K2c＞K3c＞K1c，故因素C選擇水平2，即煎煮兩次。綜上所述，確定黃連解毒湯全方水煎煮的最佳提取工藝為A3B2C2，即加18倍量水煎煮2次，第1次10倍量水、第2次8倍量水，每次1.5 h。

3.2 黃連解毒湯全方水提取最佳工藝驗(yàn)證

黃連、黃柏、黃芩、梔子全方藥材按6∶4∶4∶6比例取3份，每份200 g，按照上述最優(yōu)工藝條件提取，提取液分別測(cè)定平均轉(zhuǎn)移率。見(jiàn)表4。

表4 最佳工藝條件驗(yàn)證

由表4可知，按正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝進(jìn)行試驗(yàn)，平均轉(zhuǎn)移率大于50%，有效成分提取較完全。

3.3 黃連解毒湯組方－配伍水提取工藝

組方－配伍五組為黃連 +黃芩、黃連 +黃柏、黃連 +梔子、黃連+黃柏+黃芩、黃連+黃柏+梔子，以黃芩+梔子、全方兩組為對(duì)照，分別以18倍量水煎煮提取各組藥物組合，第1次10倍量水、第2次8倍量水，每次1.5 h。煎煮后各樣品按照2.4項(xiàng)法制備樣品溶液1′～7′，按照2.3項(xiàng)檢測(cè)樣品1′～7′中上述5種指標(biāo)性成分的含量，計(jì)算各成分相對(duì)藥材的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 組方-配伍試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

4 討論

4.1 由于黃連解毒湯各藥配伍的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，在傳統(tǒng)煎煮過(guò)程中，黃連中的季銨堿與黃芩中的黃芩苷發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生大量沉淀;藥味不同配伍煎煮對(duì)黃連中小檗堿的溶出率亦有顯著性影響，黃連與黃柏配伍，生物堿含量增高，但其溶出率不等于兩藥材中小檗堿含量的簡(jiǎn)單加和;黃連與黃芩、黃連與梔子配伍，小檗堿溶出率均較單味黃連水煎液降低;全方煎煮時(shí)，小檗堿溶出率則是各味藥材協(xié)同作用的結(jié)果［3］。因此在全方及不同組合的水溶液環(huán)境中各指標(biāo)性成分的含量和相互影響的研究基礎(chǔ)上，通過(guò)建立全方及不同組合中各指標(biāo)性成分體外濃度與體內(nèi)吸收、分布的相關(guān)性，對(duì)于闡明復(fù)方量效關(guān)系的具有實(shí)質(zhì)性意義。

4.2 本論文通過(guò)正交試驗(yàn)確立了全方水煎煮的最佳工藝，以期在水煎煮工藝操作中，獲得穩(wěn)定的、可再現(xiàn)的全方提取物，為后續(xù)的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。在確立水煎煮最佳工藝后，我們分別考察不同組合對(duì)黃連中生物堿轉(zhuǎn)移率的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)方水溶液體系中，梔子苷的含量基本保持穩(wěn)定，生物堿轉(zhuǎn)移率受到黃芩苷的影響較大，但全方共煎的轉(zhuǎn)移率仍較黃連黃柏配伍組合高，因此，能否從化學(xué)成分的角度印證傳統(tǒng)湯劑組方的合理性，值得進(jìn)一步商榷。

4.3 中藥間合理的配伍是中藥復(fù)方的核心，也是復(fù)方不同于單味藥的主要奧妙所在。古人說(shuō)“藥有個(gè)性之特長(zhǎng)，方有合群之妙用”。中藥復(fù)方多以湯劑入藥，傳統(tǒng)湯劑是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，按君臣佐使的組方原則配伍的有機(jī)組合，深入地對(duì)各藥味進(jìn)行化學(xué)成分研究，探討藥味各組分在療效中所起的作用和組方配伍原則，進(jìn)而闡明湯劑的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理，是創(chuàng)立和研制新方的重要依據(jù)。

［1］郭立瑋，潘林梅，朱華旭.中藥提取物伴生物質(zhì)的生物藥劑學(xué)特性及其制劑學(xué)意義［J］. 中草藥，2007，38(9):1281－1286.

［2］曹春林主編.中藥藥劑學(xué)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1990:559－575.

［3］陳光亮，張秀榮，王欽茂.黃連解毒湯的化學(xué)及藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］. 中草藥，2008，39(6):935－938.

［4］李華安.黃連解毒湯的研究及應(yīng)用［J］.山東中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，19(5):312.

［5］張藝平，韓 鵬.黃連解毒湯治療腦病的藥理與臨床研究新進(jìn)展［J］. 中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2003，16(12):1832－1834.

［6］任玲玲，薛興亞.黃連解毒湯高效液相色譜分析方法的建立［J］. 世界科學(xué)技術(shù)－中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2005，7(5):41－44.

［7］沈 嘉，趙建平.黃連解毒湯質(zhì)量考察［J］.中成藥，1999，21(10):502－504.

［8］中國(guó)藥典［S］.2005:173，211－212，214－215.