王一騰，白希壯，朱志勇，白茗，張杭州

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院骨科；2.92期七年制，沈陽 110001）

重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2對殼聚糖-明膠多孔復(fù)合支架理化性能的影響

王一騰1，白希壯1，朱志勇1，白茗2，張杭州1

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院骨科；2.92期七年制，沈陽 110001）

目的 以組織工程學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，制備殼聚糖-明膠/骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）多孔復(fù)合支架，討論殼聚糖與明膠的不同配比及向復(fù)合材料中加入BMP-2對支架的微觀結(jié)構(gòu)和理化性能的影響。方法 分別用不同配比的殼聚糖和明膠制備復(fù)合支架，并向1組配比中加入BMP-2。以掃描電鏡觀察支架的表面特征，測定支架的孔徑值、材料的吸水率及表觀密度。結(jié)果 殼聚糖-明膠多孔復(fù)合支架比表面積大，內(nèi)孔結(jié)構(gòu)多形性高、且大量連通；殼聚糖與明膠配比為4︰1時的復(fù)合支架孔徑最小，孔壁最厚；配比為1︰4時孔徑最大，孔壁最?。粴ぞ厶桥c明膠配比為1︰1時吸水率及表觀密度達(dá)到最大，分別為（318±75）%和（0.085±0.013）g/cm3；向復(fù)合支架中加入BMP-2對支架的微觀結(jié)構(gòu)、吸水率及表觀密度無明顯影響。結(jié)論 應(yīng)用冷凍干燥法可以成功制備殼聚糖-明膠多孔復(fù)合支架，支架的微觀結(jié)構(gòu)與理化性能與殼聚糖與明膠的配比密切相關(guān)，向支架中加入BMP-2對材料的理化性能無明顯影響。

殼聚糖；明膠；理化性能；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2；自體軟骨細(xì)胞移植

由于理想的自體軟骨細(xì)胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI）可生成全層的透明軟骨［1，2］，近年來開放式 ACI技術(shù)不斷被用于治療軟骨缺損并取得了良好效果。但由于尚未找到適合關(guān)節(jié)鏡下操作的載體，因此，臨床上尚未能應(yīng)用關(guān)節(jié)鏡完成ACI。

殼聚糖是細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）結(jié)構(gòu)類似物，具有可生物降解、生物相容性良好、低抗原性、促進(jìn)傷口愈合、抗菌等特性，它可與帶負(fù)電的生物大分子，如明膠形成聚電解質(zhì)配合物［3，4］，殼聚糖還具有較好的力學(xué)性能，易于加工成型［5］。明膠是膠原的部分變性衍生物，無抗原性，生物相容性好，可生物降解［6］。殼聚糖具有多種生物活性，而明膠則有利于細(xì)胞的貼附，增殖及分化［7］；另外，殼聚糖和明膠均具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成及維持軟骨細(xì)胞形態(tài)與表型的特征，因此，殼聚糖-明膠復(fù)合支架被認(rèn)為在人工皮膚［3，5］、肝組織工程［8］、骨組織工程［9］及軟骨組織工程等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。但由于對其在軟骨組織工程領(lǐng)域的相關(guān)研究有限，殼聚糖-明膠復(fù)合支架還未應(yīng)用于臨床治療關(guān)節(jié)軟骨缺損或成為關(guān)節(jié)鏡下ACI的載體。本研究以組織工程學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，制備殼聚糖-明膠/骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）多孔復(fù)合支架，探討了殼聚糖與明膠的不同配比及向復(fù)合材料中加入BMP-2對支架的微觀結(jié)構(gòu)和理化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

殼聚糖（Amresco公司，脫乙酰度>75%）；明膠（Amresco公司）；重組人BMP-2（PeproTech公司）；冰醋酸（分析純，沈陽化學(xué)試劑廠）；去離子水。

1.2 殼聚糖-明膠多孔復(fù)合支架的制備

配制0.2mol/L醋酸溶液；將一定質(zhì)量的殼聚糖溶于0.2mol/L醋酸，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的殼聚糖溶液；配制2%明膠溶液；將2%殼聚糖和2%明膠溶液按體積比4︰1，1︰1，1︰4比例混合；并向另一份體積比為4︰1的溶液中加入BMP-22μg。共制備4組混合液；將4組混合液注入直徑為8cm的玻璃器皿中，置于-70℃冷凍60min，移入冷凍干燥機內(nèi)（-50℃，600mT）抽干48h，制成殼聚糖-明膠（BMP-2）多孔復(fù)合三維支架材料，烘干備用。

1.3 支架性能測定

1.3.1 掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察支架的結(jié)構(gòu)：取直徑0.5cm殼聚糖-明膠多孔復(fù)合支架，其斷裂面經(jīng)離子濺射儀噴金鍍膜后，在掃描電鏡下觀察其結(jié)構(gòu)；取20個孔計算孔徑，并計算平均值。

1.3.2 支架吸水率的測定：切取干燥殼聚糖-明膠多孔復(fù)合支架材料并稱質(zhì)量（W0），浸于37℃磷酸緩沖液中30min后取出，用濾紙吸干表面的水分后稱質(zhì)量（W30）。計算吸水率 X（%）=（W30-W0）/W0×100。每份樣品重復(fù)操作10次，取平均值。

1.3.3 支架表觀密度測定：用游標(biāo)卡尺測定支架材料的直徑（D）和厚度（H），用電子天平稱量支架材料的質(zhì)量（W），計算材料的表觀密度ρ=W/［π×（D/2）2×H］。每份樣品重復(fù)操作10次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 電鏡下殼聚糖-明膠多孔復(fù)合支架的結(jié)構(gòu)

表14種復(fù)合支架的孔徑、吸水率及表觀密度Ta b.1Po r e d i a me t e r，r a t e o f w a t e r a b s o r p t i o n，a n d s u r f a c e d e n s i t y o f 4k i n d s o f c h i t o s a n-g e l a t i n s c a f f o l d s Volume ration of chitosan to gelatin BMP-2 Pore diameter（μm） Rate of water absorption（%） Surface density（g/cm3）4︰1 - 81±7 171±21 0.051±0.0074︰1 + 83±7 177±17 0.051±0.0111︰1 - 130±21 318±75 0.085±0.0131︰4 - 173±27 287±40 0.035±0.002

圖1A～圖1D分別是殼聚糖與明膠配比為4︰1、4︰1（加入 BMP-2）、1︰1、1︰4時復(fù)合支架的掃描電鏡照片。4種支架的孔徑值測定結(jié)果見表1。

SEM下4種支架的微觀結(jié)構(gòu)對比結(jié)果提示：殼聚糖-明膠多孔復(fù)合支架比表面積大，內(nèi)孔結(jié)構(gòu)多形性高、且大量連通；殼聚糖與明膠配比為4︰1時的復(fù)合支架孔徑最小，孔壁最厚；配比為1︰4時孔徑最大，孔壁最??；向復(fù)合支架中加入BMP-2對支架的微觀結(jié)構(gòu)無明顯影響。

2.2 殼聚糖與明膠的配比及BMP-2對復(fù)合支架吸水率的影響

結(jié)果如表1所示，殼聚糖與明膠配比為4︰1時材料的吸水率小于1︰4配比時的吸水率；殼聚糖與明膠配比為1︰1時吸水率達(dá)到最大［（318±75）%］；向復(fù)合支架中加入BMP-2對支架的吸水率無顯著影響。

2.3 殼聚糖與明膠的配比及BMP-2對復(fù)合支架表觀密度的影響

結(jié)果如表1所示，殼聚糖與明膠配比為4︰1時材料的表觀密度大于1︰4配比時的表觀密度；當(dāng)殼聚糖與明膠配比為1︰1時表觀密度達(dá)到最大［（0.085±0.013）g/cm3］；向復(fù)合支架中加入 BMP-2對支架的表觀密度無顯著影響。

2.4 殼聚糖與明膠的配比與材料表觀密度的關(guān)系

殼聚糖與明膠的配比與材料表觀密度的關(guān)系見圖2。在其它情況不變的條件下，我們預(yù)測的殼聚糖與明膠的配比與材料表觀密度的完整關(guān)系見圖3。以上曲線將隨著實驗的進(jìn)行而不斷修正和完善。

3 討論

殼聚糖-明膠復(fù)合支架的微觀結(jié)構(gòu)及理化性能受多方面因素影響，如混合液中固體含量、殼聚糖與明膠的配比、預(yù)凍溫度等。本實驗在制備復(fù)合支架的過程中，控制其他條件不變，改變殼聚糖與明膠的配比并向其中1組配比中加入BMP-2，以觀察其對支架的微觀結(jié)構(gòu)及理化性能的影響。

有研究通過X射線衍射證明，在殼聚糖中加入明膠可以增加支架結(jié)構(gòu)的多形性。與單純的殼聚糖支架相比，細(xì)胞在殼聚糖-明膠復(fù)合支架上分布及增殖的更加理想。比較在單純殼聚糖支架及殼聚糖-明膠復(fù)合支架上培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖及存活率發(fā)現(xiàn)，殼聚糖-明膠復(fù)合支架可改善細(xì)胞的效能（cellular efficiency）［10］。比較單純殼聚糖支架的 SEM照片及本實驗復(fù)合支架的SEM照片可看出復(fù)合支架的內(nèi)孔形態(tài)更加多樣，且孔徑值變化范圍較大。將殼聚糖與明膠復(fù)合的優(yōu)點還在于殼聚糖的結(jié)構(gòu)與特性與糖胺聚糖及其衍生物相似，具有多種生物活性；而明膠則有利于細(xì)胞的黏附，增殖及分化。

較多研究認(rèn)為向殼聚糖中加入明膠及改變殼聚糖與明膠的配比可以改變支架的理化性能，如孔徑值、孔隙率、表觀密度、機械性能等，但具體影響的趨勢還不明確［11，12］。本實驗用殼聚糖與明膠的3種配比（4︰1，1︰1，1︰4）配制復(fù)合支架，用電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)、表觀密度、吸水率來評價不同配比的支架的理化性能。結(jié)果顯示，殼聚糖與明膠的不同配比是改變復(fù)合支架的微觀結(jié)構(gòu)和理化性能的變量之一。通過總結(jié)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，各項測量數(shù)據(jù)的變化趨勢與配比的改變有較直接的相關(guān)性。我們在3組配比的基礎(chǔ)上加以合理的預(yù)測及進(jìn)一步的實驗便可以掌握某種數(shù)據(jù)的整個變化趨勢。掌握支架材料的理化性能數(shù)據(jù)的可控性對臨床上制作組織工程支架有很大的指導(dǎo)意義。

將生長因子或其他具有生物活性的物質(zhì)與支架材料復(fù)合的意義具有雙重性：一方面向支架中加入上述物質(zhì)可以明顯改善在其上培養(yǎng)細(xì)胞的分化、增殖、代謝等活動；另一方面，一種降解速率理想的支架材料可以實現(xiàn)生長因子等有生物活性物質(zhì)的緩慢而有效的釋放。生長因子的本質(zhì)為多肽或蛋白，如BMP-2、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等生長因子與支架復(fù)合而發(fā)揮生物活性作用時質(zhì)量的數(shù)量級在μg。因此，我們預(yù)測在支架材料中復(fù)合生長因子對材料的理化性能不會有明顯影響。有研究指出，在殼聚糖-明膠復(fù)合支架中加入bFGF對支架的孔徑值及孔隙率無明顯影響［13］。本實驗對比了加入BMP-2前后的殼聚糖與明膠配比為4︰1的兩組復(fù)合支架的微觀結(jié)構(gòu)、吸水率及表觀密度，兩組支架的各項測量數(shù)據(jù)無明顯差別。在考慮到測量的誤差等因素外，認(rèn)為在復(fù)合支架中加入BMP-2對材料的微觀結(jié)構(gòu)及理化性能無明顯影響。

綜上所述，應(yīng)用冷凍干燥法可以成功制備殼聚糖-明膠多孔復(fù)合支架，支架的微觀結(jié)構(gòu)與理化性能與殼聚糖與明膠的配比密切相關(guān)。向支架中加入BMP-2對材料的理化性能無明顯影響。殼聚糖-明膠復(fù)合支架在軟骨組織工程領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。對材料的理化性能的進(jìn)一步研究以及細(xì)胞毒性實驗、動物模型實驗等研究將使其可能成為關(guān)節(jié)鏡下ACI的理想載體。

［1］Xia W，Liu W.Tissue engineering of cartilage with the use of chitosan-gelatin complex scaffolds ［J］.Wiley InterScience，2004，6（18）：373-380.

［2］Insall S.Surger of the knee［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社.2006：313-359.

［3］Liu H，Mao J，Yao K，et al.Astudy on a chitosan-gelatin-hyaluronic acid scaffold as artificial skin in vitro and its tissue engineering applications［J］.JBiomater Sci Polym Ed，2004，15（1）：25-40.

［4］Lee SB，Kim YH，Chong MS，et al.Study of gelatin-containing artificial skin V：fabrication of gelatin scaffolds using a salt-leaching method［J］.Biomaterials，2005，26（14）：1961-1968.

［5］高珊，趙莉，崔磊，等.殼聚糖-明膠支架材料的制備及性能研究［J］.組織工程與重建外科雜志，2005，1（6）：316-318.

［6］Brown RA，Smith KD，Angus McGrouther D.Strategies for cell engineering in tissue repair［J］.Wound Repair Regen，1997，5（3）：212-221.

［7］Xia W，Liu W.Tissue engineering of cartilage with the use of chitosan-gelatin complex scaffolds［J］.JBiomed Mater Res BAppl Biomater，2004，71（2）：373-380.

［8］Jiankang H，Dichen L，Yaxiong L，et al.Preparation of chitosangelatin hybrid scaffolds with well-organized microstructures for hepatic tissue engineering［J］.Acta Biomate，2009，5（1）：453-461.

［9］Yin Y，Ye F，Cui J，et al.Preparation and characterization of macroporous chitosan-gelatin beta-tricalcium phosphate composite scaffolds for bone tissue engineering［J］.JBiomed Mater Res A，2003，67（3）：844-855.

［10］Thein-Han WW，Saikhun J，Pholpramoo C，et al.Chitosan-gelatin scaffolds for tissue engineering：physico-chemical properties and biological response of buffalo embryonic stem cells and transfectant of GFP-buffalo embryonic stem cells［J］.Acta Biomater，2009，5（9）：3453-3466.

［11］Huang Y，Onyeri S，Siewe M，et al.In vitro characterization of chitosan-gelatin scaffolds for tissue engineering［J］.Biomaterials，2005，26（36）：7616-7627.

［12］Zhao F，Yin Y，Lu WW，et al.Preparation and histological evaluation ofbiomimetic three-dimensionalhydroxyapatite/chitosangelatin network composite scaffolds ［J］.Biomaterials，2002，23（15）：3227-3234.

［13］Liu H，F(xiàn)an H，Cui Y，et al.Effects of the controlled-released basic fibroblast growth factor from chitosan-gelatin microspheres on human fibroblastscultured on achitosan-gelatin scaffold［J］.Biomacromolecules，2007，8（5）：1446-1455.

（編輯 王又冬，英文編輯 陳 姜）

Effect of Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2on Physicochemical Properties of Porous Chitosan-gelatin Scaffold

WANGYi-teng1，BAIXi-zhuang1，ZHUZhi-yong1，BAIMing2，ZHANGHang-zhou1
（1.Department of Orthopedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.The 92th Class，7-year System，F(xiàn)aculty of Clinical Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the physicochemical properties of porous chitosan-gelatin scaffold prepared with different proportions of chitosan and gelatin and incorporated with bone morphogenetic protein-2（BMP-2）.MethodsChitosan-gelatin scaffolds were prepared with different proporations of chitosan and gelatin，and the volume ratios of these two materials were 4∶1，1∶1，and 1∶4，respectively.BMP-2was added into the scaffold with the volume ratio of chitosan to gelatin of 4∶1.The microstructure and porosity were observed under scanning electron microscope，and the pore diameter，rate of water absorption，and surface density were determined.ResultsFor chitosan-gelatin scaffold，the specific surface area was large，and the endoporus was highly polymorphic and with many interconnections among them.The chitosan-gelatin scaffold with the volume ratio of 4∶1had minimum pore diameter and maximum thickness，and the scaffold with the volume ratio of 1∶4had maximum pore diameter and minimum thickness.The rate of water absorption and surface density reached the maximum values （318%±75%and 0.085±0.013g/cm3）when the volume ratio was 1∶4.No obvious changes in the microstructure，rate of water absorption，and surface density were found after BMP-2was added.ConclusionWe can prepare the porous chitosan-gelatin scaffold with freeze drying method.The physicochemical properties of the scaffold are correlated with the volume ratio of chitosan to gelatin，but not affected by BMP-2.

chitosan；gelatin；physicochemical property；bone morphogenetic protein-2；autologous chondrocyte implantation

R318.08

A

0258-4646（2010）11-0912-03

遼寧省科技計劃項目（2007225015）

王一騰（1984-），男，醫(yī)師，碩士.

白希壯，E-mail：zpmhh@sina.com

2010-05-10