喬利英，劉文忠，周忠孝

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801）

微衛(wèi)星被用于包括人在內(nèi)的各種動物基因作圖的首選標(biāo)記。在畜禽品種資源分類、遺傳多樣性評估、保種和品種的培育等方面，也是重要的標(biāo)記之一。利用微衛(wèi)星制作DNA指紋圖，通過分析進(jìn)行個(gè)體、品種（系）鑒定是微衛(wèi)星的最早應(yīng)用之一［1］。同時(shí)，在定位功能基因、個(gè)體與親緣關(guān)系的鑒定、數(shù)量性狀基因座（quantitative trait loci，QTL）定位及連鎖分析、標(biāo)記輔助選擇等方面起著重要作用，尤其在群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹等方面有廣泛應(yīng)用。利用微衛(wèi)星標(biāo)記已對某些綿羊品種間的進(jìn)化關(guān)系和遺傳距離，品種內(nèi)的遺傳變異等進(jìn)行了研究。所涉及品種對于家用綿羊可以是起源于某一品種的具有較近親緣關(guān)系的品種［2］，或者對于野生原始綿羊可以是同一物種的若干地理亞種［3］，但絕大多數(shù)研究則集中在純種綿羊品種上。

本研究擬以3個(gè)引入品種、1個(gè)本地品種和用于山西肉用綿羊母本品系培育的這些品種間的6個(gè)雜交組合為對象，研究微衛(wèi)星變異和群體遺傳結(jié)構(gòu)，旨在為雜交育種和新品系選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所用的219個(gè)個(gè)體血液樣品均采自山西省沁水示范牧場，采集的10個(gè)品種（系）包括南非肉用美利奴羊（43只）、考力代羊（28只）、夏洛來羊（4只）、本地綿羊（23只）、（夏洛來羊×考力代羊）F1（30只）、（夏洛來羊×考力代羊）F2（24只）、南×（夏×考）F1（28只）、南×（夏×考）F2（21只）、夏洛來羊×本地綿羊（6只）、南非肉用美利奴羊×本地綿羊（12只）。頸靜脈采血5 mL，肝素鈉抗凝（1 mL），－70℃條件下保存。

1.2 方法 參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，進(jìn)行血液DNA提取。選出多態(tài)信息含量高、雜合度高、符合孟德爾遺傳規(guī)律的微衛(wèi)星基因座進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測、電泳分型。以ΦX174DNA/Hinf I為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用凝膠成像系統(tǒng)攜帶的Alphamager（v 5.1）軟件計(jì)算微衛(wèi)星等位基因片段大小。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法 采用FSTAT（Version 2.9.3）軟件［4］計(jì)算有效等位基因數(shù)（ne）、等位基因豐度（rs）、多態(tài)信息含量（PIC）、觀察的雜合度（Ho）、基因多樣性（Hs）以及Wright的F－統(tǒng)計(jì)量；用GeneClass2軟件［5］進(jìn)行個(gè)體的分配測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種內(nèi)遺傳變異 4個(gè)微衛(wèi)星基因座在10個(gè)綿羊種群中共檢測到41個(gè)等位基因，其中，BP33、CSSM018、IDVGA46和MCM148基因座分別檢測到15、7、10和9個(gè)等位基因數(shù)。說明所選擇微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳信息比較豐富。各基因座的有效等位基因數(shù)（ne）、等位基因豐度（rs）和基因多態(tài)性信息含量（PIC）見表1。

表1 不同群體中微衛(wèi)星基因座的有效等位基因數(shù)（ne）、等位基因豐度（rs）和多態(tài)信息含量（PIC）

總?cè)后w的平均雜合度（Ht）和經(jīng)樣本校正的平均雜合度（Ht′）、種群內(nèi)平均雜合度（Hs）以及平均觀察雜合度（Ho）見表 2。Ht、Ht′、Hs和 Ho 的總體均數(shù)分別為 0.833、0.838、0.789和0.477。從各基因座來看，以BP33的雜合度最大，而MCM148的雜合度最小。

表2 微衛(wèi)星基因座的雜合度估值

2.2 種群間的遺傳分化 用來衡量群體間遺傳分化程度的F－統(tǒng)計(jì)量估計(jì)值列于表3。就不同基因座而言，F(xiàn)st介于0.069～0.106之間，總體均值0.092，說明群體的總變異有9.2%來自種群間的差異，而剩余的90.8%來自種群內(nèi)。Fis介于0.311～0.460間，總體均值0.359，表明各種群均存在較高程度的非隨機(jī)交配；Fit介于0.391～0.478間，總體均值0.424，則反映群體有較高的總體近交系數(shù)。

表3 各微衛(wèi)星基因座Wright的F-統(tǒng)計(jì)量

2.3 分配測定 分配測定是將某些個(gè)體分配到它最可能所在群體的一種方法。利用4個(gè)微衛(wèi)星的信息用3類方法進(jìn)行個(gè)體分配測定的結(jié)果見表4。由表4可見，正確分配率介于19.18%～32.42%。以DA距離法和繩距法最為準(zhǔn)確，正確分配率均為32.42%，兩種貝葉斯方法，正確分配率也在30%以上。

表4 利用4個(gè)微衛(wèi)星進(jìn)行分配測定的準(zhǔn)確性

當(dāng)利用單標(biāo)記信息用上述正確分配率最高的方法進(jìn)行分配測定時(shí)，發(fā)現(xiàn)測定的準(zhǔn)確性因標(biāo)記基因座的不同而有所不同（表5）。對于BP33和IDVGA46，貝葉斯方法較好，其它兩個(gè)標(biāo)記以距離法為優(yōu)。

表5 利用單個(gè)微衛(wèi)星進(jìn)行分配測定的準(zhǔn)確性

3 討論與結(jié)論

3.1 群體遺傳多樣性 多態(tài)性信息含量（PIC）是衡量基因多態(tài)性的較好指標(biāo)。Botstein等首先提出了衡量基因變異程度高低的多態(tài)性信息含量指標(biāo)［6］：當(dāng)PIC＞0.50時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；0.25＜PIC＜0.50時(shí)，為中度多態(tài)性位點(diǎn)；PIC＜0.25時(shí)，為低度多態(tài)位點(diǎn)。本研究所選4個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在10個(gè)綿羊種群中的PIC介于0.630～0.801之間，均值為0.72，均屬于高度多態(tài)，表明所選的微衛(wèi)星標(biāo)記可用于綿羊品種之間遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。Tomasco等［7］的研究結(jié)果與本研究所得到的PIC值相近；而 Buchanan等［8］和賈斌等［9］的研究中 PIC 值均較本研究低。本文中PIC值較大的原因可能有：①所選標(biāo)記基因座與其它研究不同；②所選種群只有4個(gè)純種，而其它都是雜種。

雜合度又稱為基因多樣性，反映各群體在多個(gè)基因座上的遺傳變異，一般認(rèn)為它是度量群體遺傳變異的一個(gè)最適參數(shù)。本研究根據(jù)Nei［10］估計(jì)的整個(gè)群體的平均雜合度Ht和Ht′分別為0.833和0.838，種群內(nèi)平均雜合度Hs和平均觀察雜合度Ho分別為0.789和0.477。其中，表示基因多樣性的Hs較Gutierrez－Espeleta等利用10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記估計(jì)的沙漠大角羊 （desert bighorn sheep）的基因多樣性（0.51）［11］明顯大，但與 Farid 等用10個(gè)微衛(wèi)星基因座研究10個(gè)綿羊品種的結(jié)果（0.74）［12］、Grigaliunaite等利用15個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記研究7個(gè)綿羊品種的結(jié)果（0.712）［13］相近。沙漠大角羊?qū)儆谝吧N群，由于種群間的交流有限甚至?xí)霈F(xiàn)嚴(yán)重近交的情況，因而遺傳多樣性較低。而其他群體均為家養(yǎng)綿羊，而且本研究中還有多個(gè)雜種，所以遺傳多樣性較高。

3.2 群體遺傳分化 Fst稱為固定指數(shù)，又稱為基因分化系數(shù)，是反映各亞群間遺傳分化的重要指標(biāo)。Fst總是非負(fù)的。Wright認(rèn)為：若Fst在0～0.05之間，表明各亞群間不存在分化；若Fst介于0.05～0.15間，為中度分化；若Fst在 0.15～0.25 之間，則為高度分化［14］。本研究中，F(xiàn)st的總體均值為0.092，即群體的總變異中，大約有9.2%是來自種群間的差異，而剩余的90.8%則來自種群內(nèi)。與Soheir等對埃及家養(yǎng)綿羊品種Fst估值（0.037）［15］和耿巖等對中國蒙系 6 個(gè)綿羊品種 Fst估值（0.039）［16］相比，本研究中各種群間的分化程度要大。主要原因可能是本研究中有多個(gè)雜種群體，由此導(dǎo)致了群體間的遺傳分化增大。

Fis也稱為內(nèi)近交系數(shù)，用來衡量各種群內(nèi)因非隨機(jī)交配引起的個(gè)體雜合度的降低；Fit則反映相對于總?cè)后w個(gè)體的總體近交程度。Fit和Fis可以為正值，也可以為負(fù)值［14］，前者表示群體內(nèi)存在近交，雜合度缺失；后者則表示遠(yuǎn)交，雜合度過量。本研究估計(jì)的Fis、Fit均為正值，總體上來說，各種群內(nèi)存在一定程度的近交。

3.3 綿羊群體的分配測定 本研究基于4個(gè)微衛(wèi)星用3類方法進(jìn)行的分配測定表明，以DA距離法和繩距法最為準(zhǔn)確，但正確分配率僅為30%多，遠(yuǎn)低于Arranz等利用18個(gè)微衛(wèi)星用同樣的方法所得到的正確分配率（98%以上）［17］。當(dāng)用3種正確分配率最高的方法，用單標(biāo)記信息進(jìn)行分配測定時(shí)，僅MCM148一個(gè)標(biāo)記的正確分配率就達(dá)32.9%，甚至高出利用4個(gè)標(biāo)記信息的正確分配率。這說明正確分配率的高低與標(biāo)記的選取和數(shù)目有關(guān)。

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