程昌勇,陳健舜,趙寒昕,白 帆,方維煥

(浙江大學動物預防醫(yī)學研究所,浙江省動物預防醫(yī)學重點實驗室,浙江杭州 310029)

單核細胞增生李斯特菌精氨酸脫亞胺酶基因的克隆及原核表達＊

程昌勇,陳健舜,趙寒昕,白 帆,方維煥＊

(浙江大學動物預防醫(yī)學研究所,浙江省動物預防醫(yī)學重點實驗室,浙江杭州 310029)

精氨酸脫亞胺酶(AD I)可能介導單核細胞增生李斯特菌抗酸應激,由arcA基因編碼。利用分子克隆技術從單核細胞增生李斯特菌10403S擴增得到AD I基因,測序正確后將其插入p ET30a表達載體中,構建該基因的原核表達質(zhì)粒p ET30a-AD I,并轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌Rosetta中進行誘導表達。核苷酸序列分析顯示,AD I基因的完整開放閱讀框為1 233 bp,編碼410個氨基酸。SDS-PAGE表明:該基因在大腸埃希菌中成功表達,重組蛋白的分子質(zhì)量約為52.5 ku。為進一步研究精氨酸脫亞胺酶的活性提供了條件,同時也為探索單核細胞增生李斯特菌抗酸應激的機理奠定了重要的基礎。

單核細胞增生李斯特菌;arcA基因;精氨酸脫亞胺酶;原核表達

單核細胞增生李斯特菌(Listeria m onocy togenes)是重要的食源性人獸共患病原菌,可引起腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀,死亡率高達30%。單核細胞增生李斯特菌為世界公共衛(wèi)生學上最重要的食源性病原菌之一。

低p H環(huán)境是食源性病原菌最常遇到的不利因素之一,如酸性食品、消化道、巨噬細胞的吞噬體以及外界環(huán)境的p H變化。因此,抗酸應激能力是單核細胞增生李斯特菌建立感染的前提,進而侵入細胞并在胞內(nèi)生存和增殖。

銅綠假單胞菌[2]、乳酸乳球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌與口腔鏈球菌等均存在精氨酸脫亞胺酶(A rginine deiminase,AD I)系統(tǒng)。AD I能夠催化精氨酸水解成瓜氨酸和氨,接著瓜氨酸經(jīng)AD I系統(tǒng)中另外兩個酶——鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC)和氨甲酰激酶(CK)的催化而轉(zhuǎn)化成鳥氨酸、氨和CO2。氨與 H+結合為NH4+,提高細菌胞質(zhì)中的p H,從而在一定程度上保護細胞免受胞外酸性因素的刺激。

Ryan S等[6]發(fā)現(xiàn)單核細胞增生李斯特菌亦含有AD I系統(tǒng)(lmo0036-lmo0043),并在細菌水平上驗證了精氨酸脫亞胺酶的活性。本課題組[7]發(fā)現(xiàn)除AD I外,該系統(tǒng)的其他成員(如OTC、CK)特異性存在于單核細胞增生李斯特菌譜系Ⅰ和Ⅱ以及伊氏李斯特菌(Listeria ivanoii)中。其中l(wèi)mo0038已被證明與細菌抵抗酸、熱應激相關。

本實驗室針對AD I代謝途徑中的核心酶AD I,進行分子克隆與表達,構建高效重組表達載體,以期為研究單核細胞增生李斯特菌的AD I生物學活性并探索細菌抗酸應激機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 單核細胞增生李斯特菌標準菌株10403S、大腸埃希菌DH5α和 Rosetta均由本實驗室保存;pMD18-T質(zhì)粒購于寶生物工程(大連)有限公司;p ET30a表達載體質(zhì)粒由本實驗室保存。1.1.2 酶及相關試劑TaqDNA polymerase、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、IPTG均購至寶生物工程(大連)有限公司;DNA Ladder M arker購自廣州東盛生物科技有限公司;dN TP M ix購自上海申能博彩生物科技有限公司;質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA割膠回收試劑盒購自上海生工有限公司;核酸電泳染料Goldview購自塞百盛生物公司;引物合成和測序均由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(10 g/L胰蛋白胨,5 g/L酵母提取物,10 g/L氯化鈉,p H7.4)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的制備 基因組抽提采用煮沸法。5 000 rpm離心收集細菌沉淀后用等體積的TZ和蒸餾水重懸,-20℃靜置45 min,接著沸水中煮10 min,立即置冰浴冷卻10 min,離心后取上清保存于-20℃以備用。

1.2.2 AD I基因引物設計及 PCR擴增 根據(jù)GenBank中發(fā)布的 AD I基因序列(Gene ID:985417),運用DNA Star軟件設計針對該基因ORF的特異性引物,并在上、下游引物分別引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點。上下游引物序列如下(下劃線部分表示酶切位點):

PCR擴增體系和程序:采用30μL反應體系:10×PCR Buffer(M g+2Plus)3μL,dN TP M ix 0.6μL,上下游引物各0.6μL,TaqDNA Polymerase 0.8μL,加雙蒸水補齊體積。反應條件:94℃預變性3 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸70 s,30個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收、純化均按照試劑盒說明進行操作。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定 將回收的AD I基因片段與pMD18-T載體于4℃C連接過夜,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α中。抽提質(zhì)粒后用 PCR方法篩選和鑒定陽性重組質(zhì)粒,并命名為pMD18-T-AD I。選取陽性質(zhì)粒送往上海英駿生物技術有限公司測序,測序結果與 GenBank中發(fā)布的AD I基因序列進行比較分析。

1.2.4 重組ADI基因表達載體的構建與表達分析

用EcoRⅠ和SalⅠ分別酶切陽性重組質(zhì)粒pMD18-TADI和表達載體p ET30a,并進行純化。回收的ADI片段與表達載體加入DNA連接酶,于4℃反應過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞,篩選出陽性重組表達質(zhì)粒,命名為p ET30a-ADI。

1.2.5 AD I基因在大腸埃希菌中的誘導表達 將構建好的重組表達質(zhì)粒p ET30a-AD I及空質(zhì)粒p ET30a分別轉(zhuǎn)化E.coliRosetta中,篩選單個陽性克隆37℃過夜培養(yǎng);過夜培養(yǎng)細菌以1∶100擴大培養(yǎng)于200 m L LB培養(yǎng)基(含100μg/m L卡那霉素)中,OD600達0.4～0.6時,加入 IPTG至終濃度為0.4 mM,37℃繼續(xù)培養(yǎng),誘導表達3 h～4 h。同時以誘導含空質(zhì)粒p ET30a的E.coliRosetta作為對照。

1.2.6 SDS-PAGE分析 分別取1 m L含重組表達質(zhì)粒p ET30a-AD I和含空質(zhì)粒p ET30a的表達產(chǎn)物,6 000 r/min離心10 min收集菌體。加入適量PBS(50 mmol/L,p H7.4)洗滌2次后,再用 PBS重懸細菌,超聲破碎細胞(300 W,4 s/4 s,99次)后,12 000 r/m in離心10 m in,分別取上清和沉淀進行SDS-PA GE試驗。

2 結果

2.1 目的基因AD I的PCR擴增

以單核細胞增生李斯特菌標準菌株10403S為模板,PCR擴增AD I基因,獲得大小為1 200 bp左右的特異性條帶,與已知的AD I基因片段大小一致(圖 1)。

2.2 AD I序列測定與分析

測序結果表明,擴增得到的AD I基因片段大小為1 233 bp,包括了起始密碼子A TG和終止密碼子TAG的完整ORF,編碼410個氨基酸,分子質(zhì)量約為47.1 ku。與 GenBank中發(fā)布的單核細胞增生李斯特菌EGD-e的AD I基因序列進行比較,兩者的核苷酸同源性為99.8%,氨基酸同源性亦為99.8%。

2.3 重組質(zhì)粒pMD18-T-AD I的鑒定

構建好的重組質(zhì)粒pMD18-T-AD I通過 PCR擴增和酶切分析進行鑒定。PCR擴增得到1 200 bp左右的特異性條帶;用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切得到大于2 000 bp的pMD18-T載體的片段和1 200 bp左右的AD I片段(圖2)。

2.4 重組表達載體p ET30a-AD I的鑒定

構建好的重組表達質(zhì)粒p ET30a-AD I隨機挑取3個～4個陽性克隆,試劑盒抽取質(zhì)粒后進行 PCR鑒定。PCR擴增得到1 200 bp左右的特異性條帶,與前期的鑒定結果一致(圖3)。

2.5 重組菌表達表達產(chǎn)物的SDS-PA GE分析

單核細胞增生李斯特菌 EGD-e的AD I分子質(zhì)量約為47.1 ku,與 His標簽融合后的表達產(chǎn)物約為52.5 ku。SDS-PAGE分析結果表明:陽性重組質(zhì)粒p ET30a-AD I轉(zhuǎn)化菌經(jīng)0.4 mM IPTG誘導后,超聲破碎細胞,分別收集上清和沉淀做可溶性分析,蛋白電泳顯示,在約50 ku處表達出很濃的條帶(箭頭標出),與預期重組蛋白的大小基本一致,并且該重組蛋白主要以不溶性包涵體形式存在,上清中幾乎看不到條帶;以含空質(zhì)粒p ET30a的重組菌做對照,經(jīng)IPTG誘導后則無目的蛋白的表達(圖4)。

圖1 AD I基因擴增電泳圖Fig.1 Amplification of ADIgene by PCR

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-T-AD I的PCR及酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18-T-ADIby PCR and enzyme restriction

圖3 重組表達質(zhì)粒p ET30a-AD I的PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant exp ression plasmid p ET30a-ADIby PCR

圖4 重組精氨酸脫亞胺酶的SDS-PAGE分析 Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant arginine deiminase

3 討論

單核細胞增生李斯特菌對環(huán)境耐受性強,可在較高的鹽濃度(10%NaCl)以及寬泛的p H(p H4.5-9)和溫度范圍(0℃～45℃)內(nèi)生長,因而單核細胞增生李斯特菌廣泛存在于自然界(包括土壤、水源、植物及動物體等),易污染各種食品(肉、奶、海產(chǎn)品及蔬菜等)。從上世紀80年代起,歐洲、北美等地多次因食品污染而暴發(fā)人李斯特菌病。針對單增李斯特的抗應激特別是抗酸應激的研究日益成為熱點。

AD I系統(tǒng)存在于多種革蘭陽性菌與革蘭陰性菌中[6]。Degnan B A等[9]以及 Gruening PM等[10]推斷該系統(tǒng)可能與細菌抗酸應激相關。張金秋等[11]、李振偉等[12]也分別報道了豬鏈球菌和變性假單胞菌中AD I的存在,并在體外表達了該酶以研究其活性。在精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)中,AD I發(fā)揮著重要的作用,它能夠催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸,同時生成NH 3和A TP。N H3可提高環(huán)境中p H值從而增強細菌抵抗酸性環(huán)境的能力,而此過程中產(chǎn)生的A TP則可以為細菌的生命活動提供能量。

單核細胞增生李斯特菌的AD I系統(tǒng)也被推測與抗酸應激有關。本課題組[7]發(fā)現(xiàn)了lmo0038基因(AD I系統(tǒng)中的一個基因)在抗酸、熱應激方面有著重要作用。但在國內(nèi)外迄今未有體外表達單核細胞增生李斯特菌的AD I并研究其生物學活性的報道。本試驗選擇p ET質(zhì)粒對編碼精氨酸脫亞胺酶的AD I基因進行原核表達,SDS-PAGE證實了該基因在大腸埃希菌中獲得高效表達,但是表達產(chǎn)物主要以沒有生物活性的包涵體形式存在。我們嘗試改變誘導溫度、IPTG濃度等條件都不能改善該蛋白的可溶性表達,這對進一步探索該酶活性造成了一定的影響。但根據(jù)報道,已有多種不同來源的AD I通過原核表達并經(jīng)蛋白復性測得該類酶的活性[13-15],我們嘗試在單核細胞增生李斯特菌中利用蛋白復性的方法對表達出來的AD I進行復性,以深入研究該酶的特性和功能,為揭示單核細胞增生李斯特菌的抗酸應激機制奠定基礎。

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Clon ing and Prokaryotic Expression of Argin ine Deim inase fromListeria m onocy togenes

CHENG Chang-yong,CHEN Jian-shun,ZHAO Han-xin,BA IFan,FAFNGWei-huan

(Institute of Preventive Veterinary M edicine of Zhejiang University and Zhejiang
Provincial Key Laboratory of Preventive Veterinary M edicine,Hangzhou,Zhejiang,310029,China)

A rginine deim inase(AD I),encoded by arcA,is one of the most impo rtant enzymes involved in acid tolerance ofListeria m onocy togenes.The AD Igene was amp lified fromL.monocy togenes10403S and cloned into pMD18-T vecto r.Sequence analysis show ed that the full length AD Igene w as 1 233 bp,encoding 410 amino acids.The gene fragment was then subcloned into p rokaryotic exp ression vector p ET30a,yielding recombinant exp ression p lasmid p ET30a-AD I,and transformed into competentE.coliRosetta cells.Exp ression of the target p rotein was induced w ith IPTG.SDS-PAGE showed a specific p rotein band w ith a mass w eight of 55.2 ku.Successful exp ression of AD I inE.colip rovides possibilities fo r further study of the enzyme activity and its role in acid tolerance mechanism ofL.monocytogenes.

Listeria monocytogenes;arcA gene;arginine deim inase;p rokaryotic exp ression

Q789

A

1007-5038(2010)04-0070-04

2010-03-23

“十一五”國家科技支撐計劃重點項目(2009BADB9B09)

程昌勇(1988-),安徽績溪人,碩士研究生,主要從事微生物與食品安全研究。＊通訊作者