程昌勇,陳健舜,趙寒昕,白 帆,方維煥

(浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所,浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310029)

單核細(xì)胞增生李斯特菌精氨酸脫亞胺酶基因的克隆及原核表達(dá)＊

程昌勇,陳健舜,趙寒昕,白 帆,方維煥＊

(浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所,浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310029)

精氨酸脫亞胺酶(AD I)可能介導(dǎo)單核細(xì)胞增生李斯特菌抗酸應(yīng)激,由arcA基因編碼。利用分子克隆技術(shù)從單核細(xì)胞增生李斯特菌10403S擴(kuò)增得到AD I基因,測(cè)序正確后將其插入p ET30a表達(dá)載體中,構(gòu)建該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒p ET30a-AD I,并轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌Rosetta中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。核苷酸序列分析顯示,AD I基因的完整開(kāi)放閱讀框?yàn)? 233 bp,編碼410個(gè)氨基酸。SDS-PAGE表明:該基因在大腸埃希菌中成功表達(dá),重組蛋白的分子質(zhì)量約為52.5 ku。為進(jìn)一步研究精氨酸脫亞胺酶的活性提供了條件,同時(shí)也為探索單核細(xì)胞增生李斯特菌抗酸應(yīng)激的機(jī)理奠定了重要的基礎(chǔ)。

單核細(xì)胞增生李斯特菌;arcA基因;精氨酸脫亞胺酶;原核表達(dá)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria m onocy togenes)是重要的食源性人獸共患病原菌,可引起腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀,死亡率高達(dá)30%。單核細(xì)胞增生李斯特菌為世界公共衛(wèi)生學(xué)上最重要的食源性病原菌之一。

低p H環(huán)境是食源性病原菌最常遇到的不利因素之一,如酸性食品、消化道、巨噬細(xì)胞的吞噬體以及外界環(huán)境的p H變化。因此,抗酸應(yīng)激能力是單核細(xì)胞增生李斯特菌建立感染的前提,進(jìn)而侵入細(xì)胞并在胞內(nèi)生存和增殖。

銅綠假單胞菌[2]、乳酸乳球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌與口腔鏈球菌等均存在精氨酸脫亞胺酶(A rginine deiminase,AD I)系統(tǒng)。AD I能夠催化精氨酸水解成瓜氨酸和氨,接著瓜氨酸經(jīng)AD I系統(tǒng)中另外兩個(gè)酶——鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC)和氨甲酰激酶(CK)的催化而轉(zhuǎn)化成鳥(niǎo)氨酸、氨和CO2。氨與 H+結(jié)合為NH4+,提高細(xì)菌胞質(zhì)中的p H,從而在一定程度上保護(hù)細(xì)胞免受胞外酸性因素的刺激。

Ryan S等[6]發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌亦含有AD I系統(tǒng)(lmo0036-lmo0043),并在細(xì)菌水平上驗(yàn)證了精氨酸脫亞胺酶的活性。本課題組[7]發(fā)現(xiàn)除AD I外,該系統(tǒng)的其他成員(如OTC、CK)特異性存在于單核細(xì)胞增生李斯特菌譜系Ⅰ和Ⅱ以及伊氏李斯特菌(Listeria ivanoii)中。其中l(wèi)mo0038已被證明與細(xì)菌抵抗酸、熱應(yīng)激相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)AD I代謝途徑中的核心酶AD I,進(jìn)行分子克隆與表達(dá),構(gòu)建高效重組表達(dá)載體,以期為研究單核細(xì)胞增生李斯特菌的AD I生物學(xué)活性并探索細(xì)菌抗酸應(yīng)激機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株10403S、大腸埃希菌DH5α和 Rosetta均由本實(shí)驗(yàn)室保存;pMD18-T質(zhì)粒購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司;p ET30a表達(dá)載體質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.2 酶及相關(guān)試劑TaqDNA polymerase、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、IPTG均購(gòu)至寶生物工程(大連)有限公司;DNA Ladder M arker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司;dN TP M ix購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司;質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA割膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工有限公司;核酸電泳染料Goldview購(gòu)自塞百盛生物公司;引物合成和測(cè)序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(10 g/L胰蛋白胨,5 g/L酵母提取物,10 g/L氯化鈉,p H7.4)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的制備 基因組抽提采用煮沸法。5 000 rpm離心收集細(xì)菌沉淀后用等體積的TZ和蒸餾水重懸,-20℃靜置45 min,接著沸水中煮10 min,立即置冰浴冷卻10 min,離心后取上清保存于-20℃以備用。

1.2.2 AD I基因引物設(shè)計(jì)及 PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中發(fā)布的 AD I基因序列(Gene ID:985417),運(yùn)用DNA Star軟件設(shè)計(jì)針對(duì)該基因ORF的特異性引物,并在上、下游引物分別引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)。上下游引物序列如下(下劃線部分表示酶切位點(diǎn)):

PCR擴(kuò)增體系和程序:采用30μL反應(yīng)體系:10×PCR Buffer(M g+2Plus)3μL,dN TP M ix 0.6μL,上下游引物各0.6μL,TaqDNA Polymerase 0.8μL,加雙蒸水補(bǔ)齊體積。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸70 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收、純化均按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定 將回收的AD I基因片段與pMD18-T載體于4℃C連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α中。抽提質(zhì)粒后用 PCR方法篩選和鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒,并命名為pMD18-T-AD I。選取陽(yáng)性質(zhì)粒送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與 GenBank中發(fā)布的AD I基因序列進(jìn)行比較分析。

1.2.4 重組ADI基因表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)分析

用EcoRⅠ和SalⅠ分別酶切陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD18-TADI和表達(dá)載體p ET30a,并進(jìn)行純化?；厥盏腁DI片段與表達(dá)載體加入DNA連接酶,于4℃反應(yīng)過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選出陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒,命名為p ET30a-ADI。

1.2.5 AD I基因在大腸埃希菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒p ET30a-AD I及空質(zhì)粒p ET30a分別轉(zhuǎn)化E.coliRosetta中,篩選單個(gè)陽(yáng)性克隆37℃過(guò)夜培養(yǎng);過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)菌以1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)于200 m L LB培養(yǎng)基(含100μg/m L卡那霉素)中,OD600達(dá)0.4～0.6時(shí),加入 IPTG至終濃度為0.4 mM,37℃繼續(xù)培養(yǎng),誘導(dǎo)表達(dá)3 h～4 h。同時(shí)以誘導(dǎo)含空質(zhì)粒p ET30a的E.coliRosetta作為對(duì)照。

1.2.6 SDS-PAGE分析 分別取1 m L含重組表達(dá)質(zhì)粒p ET30a-AD I和含空質(zhì)粒p ET30a的表達(dá)產(chǎn)物,6 000 r/min離心10 min收集菌體。加入適量PBS(50 mmol/L,p H7.4)洗滌2次后,再用 PBS重懸細(xì)菌,超聲破碎細(xì)胞(300 W,4 s/4 s,99次)后,12 000 r/m in離心10 m in,分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PA GE試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因AD I的PCR擴(kuò)增

以單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株10403S為模板,PCR擴(kuò)增AD I基因,獲得大小為1 200 bp左右的特異性條帶,與已知的AD I基因片段大小一致(圖 1)。

2.2 AD I序列測(cè)定與分析

測(cè)序結(jié)果表明,擴(kuò)增得到的AD I基因片段大小為1 233 bp,包括了起始密碼子A TG和終止密碼子TAG的完整ORF,編碼410個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量約為47.1 ku。與 GenBank中發(fā)布的單核細(xì)胞增生李斯特菌EGD-e的AD I基因序列進(jìn)行比較,兩者的核苷酸同源性為99.8%,氨基酸同源性亦為99.8%。

2.3 重組質(zhì)粒pMD18-T-AD I的鑒定

構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pMD18-T-AD I通過(guò) PCR擴(kuò)增和酶切分析進(jìn)行鑒定。PCR擴(kuò)增得到1 200 bp左右的特異性條帶;用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切得到大于2 000 bp的pMD18-T載體的片段和1 200 bp左右的AD I片段(圖2)。

2.4 重組表達(dá)載體p ET30a-AD I的鑒定

構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒p ET30a-AD I隨機(jī)挑取3個(gè)～4個(gè)陽(yáng)性克隆,試劑盒抽取質(zhì)粒后進(jìn)行 PCR鑒定。PCR擴(kuò)增得到1 200 bp左右的特異性條帶,與前期的鑒定結(jié)果一致(圖3)。

2.5 重組菌表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PA GE分析

單核細(xì)胞增生李斯特菌 EGD-e的AD I分子質(zhì)量約為47.1 ku,與 His標(biāo)簽融合后的表達(dá)產(chǎn)物約為52.5 ku。SDS-PAGE分析結(jié)果表明:陽(yáng)性重組質(zhì)粒p ET30a-AD I轉(zhuǎn)化菌經(jīng)0.4 mM IPTG誘導(dǎo)后,超聲破碎細(xì)胞,分別收集上清和沉淀做可溶性分析,蛋白電泳顯示,在約50 ku處表達(dá)出很濃的條帶(箭頭標(biāo)出),與預(yù)期重組蛋白的大小基本一致,并且該重組蛋白主要以不溶性包涵體形式存在,上清中幾乎看不到條帶;以含空質(zhì)粒p ET30a的重組菌做對(duì)照,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后則無(wú)目的蛋白的表達(dá)(圖4)。

圖1 AD I基因擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Amplification of ADIgene by PCR

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-T-AD I的PCR及酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18-T-ADIby PCR and enzyme restriction

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒p ET30a-AD I的PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant exp ression plasmid p ET30a-ADIby PCR

圖4 重組精氨酸脫亞胺酶的SDS-PAGE分析 Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant arginine deiminase

3 討論

單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)環(huán)境耐受性強(qiáng),可在較高的鹽濃度(10%NaCl)以及寬泛的p H(p H4.5-9)和溫度范圍(0℃～45℃)內(nèi)生長(zhǎng),因而單核細(xì)胞增生李斯特菌廣泛存在于自然界(包括土壤、水源、植物及動(dòng)物體等),易污染各種食品(肉、奶、海產(chǎn)品及蔬菜等)。從上世紀(jì)80年代起,歐洲、北美等地多次因食品污染而暴發(fā)人李斯特菌病。針對(duì)單增李斯特的抗應(yīng)激特別是抗酸應(yīng)激的研究日益成為熱點(diǎn)。

AD I系統(tǒng)存在于多種革蘭陽(yáng)性菌與革蘭陰性菌中[6]。Degnan B A等[9]以及 Gruening PM等[10]推斷該系統(tǒng)可能與細(xì)菌抗酸應(yīng)激相關(guān)。張金秋等[11]、李振偉等[12]也分別報(bào)道了豬鏈球菌和變性假單胞菌中AD I的存在,并在體外表達(dá)了該酶以研究其活性。在精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)中,AD I發(fā)揮著重要的作用,它能夠催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸,同時(shí)生成NH 3和A TP。N H3可提高環(huán)境中p H值從而增強(qiáng)細(xì)菌抵抗酸性環(huán)境的能力,而此過(guò)程中產(chǎn)生的A TP則可以為細(xì)菌的生命活動(dòng)提供能量。

單核細(xì)胞增生李斯特菌的AD I系統(tǒng)也被推測(cè)與抗酸應(yīng)激有關(guān)。本課題組[7]發(fā)現(xiàn)了lmo0038基因(AD I系統(tǒng)中的一個(gè)基因)在抗酸、熱應(yīng)激方面有著重要作用。但在國(guó)內(nèi)外迄今未有體外表達(dá)單核細(xì)胞增生李斯特菌的AD I并研究其生物學(xué)活性的報(bào)道。本試驗(yàn)選擇p ET質(zhì)粒對(duì)編碼精氨酸脫亞胺酶的AD I基因進(jìn)行原核表達(dá),SDS-PAGE證實(shí)了該基因在大腸埃希菌中獲得高效表達(dá),但是表達(dá)產(chǎn)物主要以沒(méi)有生物活性的包涵體形式存在。我們嘗試改變誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度等條件都不能改善該蛋白的可溶性表達(dá),這對(duì)進(jìn)一步探索該酶活性造成了一定的影響。但根據(jù)報(bào)道,已有多種不同來(lái)源的AD I通過(guò)原核表達(dá)并經(jīng)蛋白復(fù)性測(cè)得該類酶的活性[13-15],我們嘗試在單核細(xì)胞增生李斯特菌中利用蛋白復(fù)性的方法對(duì)表達(dá)出來(lái)的AD I進(jìn)行復(fù)性,以深入研究該酶的特性和功能,為揭示單核細(xì)胞增生李斯特菌的抗酸應(yīng)激機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

[1] Low J C,Donachie W.A review ofListeria monocytogenesand listeriosis[J].Vet J,1997,153(1):9-29.

[2] Bourdineaud J P,HeierliD,Gamper M,et al.Characterization of the arcD arginine:ornithine exchanger ofPseudomonas aeruginosa.Localization in the cytop lasmic membrane and a topologicalmodel[J].J Biol Chem,1993,268(8):5417-5424.

[3] Budin-Verneuil A,Maguin E,Auffray Y,et al.Genetic structure and transcriptional analysis of the arginine deiminase(ADI)cluster inLactococcus lactisM G1363[J].Can J Microbiol,2006,52(7):617-622.

[4] Dong Y,Chen Y Y,Snyder J A,et al.Isolation and molecular analysis of the gene cluster for the arginine deiminase system from Strep tococcus gordonii DL 1[J].App l Environ M icrobiol,2002,68(11):5549-5553.

[5] Zuniga M,Perez G,F Gonzalez-Candelas.Evolution of arginine deiminase(AD I)pathway genes[J].Mol Phylogenet Evol,2002,25(3):429-444.

[6] Ryan S,Begley M,Gahan C G,et al.Molecular characterization of the arginine deiminase system inListeria monocytogenes:regulation and role in acid tolerance[J].Environ Microbiol,2009,11(2):432-445.

[7] Chen J,Jiang L,Chen Q,et al.lmo0038 is involved in acid and heat stress responses and specific forListeria monocytogeneslineages I and II,and Listeria ivanovii[J].Foodborne Pathog Dis,2009,6(3):365-376.

[8] Gandhi M,Chikindas M L.Listeria:A foodborne pathogen that know s how to survive[J].Int J Food M icrobiol,2007,113(1):1-15.

[9] Degnan B A,Fontaine M C,Doebereiner A H,et al.Characterization of an isogenic mutant ofStreptococcus pyogenesManf redo lacking the ability to make streptococcal acid glycop rotein[J].Infect Immun,2000,68(5):2441-2448.

[10] Gruening P,Fulde M,Valentin-Weigand P,et al.Structure,regulation,and putative function of the arginine deiminase system ofStrep tococcus suis[J].J Bacteriol,2006,188(2):361-369.

[11] 張金秋,陸承平.豬鏈球菌國(guó)內(nèi)分離株精氨酸脫亞氨酶的克隆表達(dá)及其活性分析[J].微生物學(xué)報(bào).2007,47(5):860-864.

[12] 李振偉,倪 曄,鄭 璞,等.變形假單胞菌精氨酸脫亞胺酶基因序列分析及其表達(dá)載體構(gòu)建[J].工業(yè)微生物,2008(4):1-6.

[13] Misawa S,Aoshima M,Takaku H,et al.High-level exp ression ofM ycop lasma argininedeiminase inEscherichia coliand its efficient renaturation as an anti-tumo r enzyme[J].J Biotechnol,1994,36(2):145-155.

[14] Park IS,Kang SW,Shin Y J,et al.A rginine deim inase:a potential inhibitor of angiogenesis and tumour grow th[J].Br J Cancer,2003,89(5):907-914.

[15] Beloussow K,Wang L,Wu J,et al.Recombinant arginine deiminase as a potential anti-angiogenic agent[J].Cancer Lett,2002,183(2):155-162.

Clon ing and Prokaryotic Expression of Argin ine Deim inase fromListeria m onocy togenes

CHENG Chang-yong,CHEN Jian-shun,ZHAO Han-xin,BA IFan,FAFNGWei-huan

(Institute of Preventive Veterinary M edicine of Zhejiang University and Zhejiang
Provincial Key Laboratory of Preventive Veterinary M edicine,Hangzhou,Zhejiang,310029,China)

A rginine deim inase(AD I),encoded by arcA,is one of the most impo rtant enzymes involved in acid tolerance ofListeria m onocy togenes.The AD Igene was amp lified fromL.monocy togenes10403S and cloned into pMD18-T vecto r.Sequence analysis show ed that the full length AD Igene w as 1 233 bp,encoding 410 amino acids.The gene fragment was then subcloned into p rokaryotic exp ression vector p ET30a,yielding recombinant exp ression p lasmid p ET30a-AD I,and transformed into competentE.coliRosetta cells.Exp ression of the target p rotein was induced w ith IPTG.SDS-PAGE showed a specific p rotein band w ith a mass w eight of 55.2 ku.Successful exp ression of AD I inE.colip rovides possibilities fo r further study of the enzyme activity and its role in acid tolerance mechanism ofL.monocytogenes.

Listeria monocytogenes;arcA gene;arginine deim inase;p rokaryotic exp ression

Q789

A

1007-5038(2010)04-0070-04

2010-03-23

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2009BADB9B09)

程昌勇(1988-),安徽績(jī)溪人,碩士研究生,主要從事微生物與食品安全研究。＊通訊作者