蒲楊柳,楊貴樹(shù),李應(yīng)進(jìn),宋春蓮,尹革芬*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201;2.晉寧縣晉城獸醫(yī)站,云南昆明 650605)

豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)是一類由多種疾病因素引起的豬呼吸道疾病,它比普通的呼吸道疾病傳播更廣、病情更重,也更難以防制,發(fā)病率30%～80%,死亡率在5%～30%或以上,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。目前PRDC己上升為規(guī)?；i場(chǎng)的主導(dǎo)疾病,在世界范圍內(nèi)廣泛地危害養(yǎng)豬業(yè)。PRDC見(jiàn)于不同生產(chǎn)模式的豬場(chǎng),包括規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng),對(duì)各個(gè)日齡段和生產(chǎn)階段的豬群,包括母豬、哺乳仔豬、保育豬和育肥豬等產(chǎn)生危害。PRDC是一種多因子疾病,在典型的病例中可以檢出豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬肺炎支原體(MH),豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(App)、豬多殺性巴氏桿菌(Pm)、副豬嗜血桿菌(H p)等常見(jiàn)幾種病原[3]。豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的,以懷孕母豬繁殖障礙和仔豬呼吸困難、高病死率及育肥豬呼吸道癥狀為特征的一種病毒病[4-5]。PRRSV可損害感染豬的免疫系統(tǒng),影響豬對(duì)其他疫病免疫抗體的產(chǎn)生,引起其他疫病的免疫失敗,常常造成多種病原的并發(fā)或繼發(fā)感染,加劇病情,使病死率增高,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)從1996年首次報(bào)道PRRS以來(lái),已有許多省份相繼有該病的報(bào)道。本病的流行特點(diǎn)及其病原特性,決定了該病一旦在豬群中出現(xiàn),將很快通過(guò)空氣和接觸及人工授精等途徑傳播開(kāi)來(lái),特別是在規(guī)模化、集約化、現(xiàn)代化的高密度養(yǎng)豬地區(qū),該病傳播尤為迅速,經(jīng)濟(jì)損失更為嚴(yán)重。本研究采用RT-PCR方法,對(duì)2008年秋季和冬季,云南省滇東、滇西、滇北、滇南和滇中32個(gè)規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)菌采取仔豬、育肥豬、母豬和公豬共552份全血進(jìn)行了PRRSV檢測(cè),以期能從病原學(xué)上更準(zhǔn)確地了解PRRSV在云南省不同地區(qū)豬群中的感染情況,為有效地預(yù)防和控制PRRS提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2008年秋季和冬季,在云南省滇東、滇西、滇北、滇南、滇中等地區(qū)共32個(gè)規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng),以無(wú)菌方式采取仔豬、育肥豬、母豬和公豬共552份肝素抗凝全血,于4℃保存。

1.1.2 主要試劑 總RNA抽提試劑T rizol購(gòu)自Invitrogen公司;M-mLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司;RNasin購(gòu)自華美公司;氯仿、異丙醇等試劑均為分析純級(jí)別。Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2 000購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank公布的美洲型VR-2332 PRRS[6]病毒ORF7基因序列和文獻(xiàn),選擇設(shè)計(jì)擴(kuò)增核衣殼蛋白基因(N)的上下游引物分別為 P1(5′-AAT GGC ACG CCA GTC AAT CA-3′)和 P2(5′-TCA TGC TAA GGG TGA TGC TG-3′)。預(yù)期擴(kuò)增 PRRSV目的基因片段為304 bp,引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2 病毒總RNA的提取 參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。根據(jù)北京百泰克生物技術(shù)有限公司的血液(液體樣本)總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取病毒總RNA,提取的RNA樣品保存在-20℃或-70℃。

1.2.3 病毒cDNA的合成 根據(jù)北京百泰克生物技術(shù)有限公司的BioTeke super RT Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行病毒cDNA的合成。

1.2.4 目的基因片段的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer(含 MgC12)5.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)4.0μL,上、下游引物 P1(10 pm ol/μL)和 P2(10 pm ol/μL)各 1.0 μL,cDNA 4.0 μL,0.5 μL Taq DNA 聚合酶(5 U/μL),加dH 2O至50μL。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃3min;95℃1min,57℃1 min,72℃1.5 min,共35個(gè)循環(huán);72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后取 5μL PCR產(chǎn)物在15 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察。

2 結(jié)果

2.1 血液樣品RT-PCR產(chǎn)物的電泳

擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度在DNA M aker DL 2 000 250 bp與500 bp之間,與預(yù)期的304 bp相符,提示擴(kuò)增產(chǎn)物可能為預(yù)期目的條帶。將此片段進(jìn)行序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果表明為正確擴(kuò)增(圖1)。

圖 1 PRRSV目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of PRRSV amplified by PCR

2.2 PRRSV流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

用擴(kuò)增PRRSV ORF7基因片段的引物,對(duì)所采血樣進(jìn)行了PRRSV感染的狀況調(diào)查,結(jié)果見(jiàn)表1和表2,從中可以看出,所有受檢地區(qū)樣品中均存在PRRSV感染,平均總陽(yáng)性率為70.1%(387/552)。在不同生長(zhǎng)階段豬群中,以仔豬帶毒的陽(yáng)性率最高,為78.5%(113/144)。在不同區(qū)域豬群中,最高為滇東(73.0%),其次為滇南(72.7%),滇中(72.2%),滇西(67.2%),滇北(65.6%)。秋季比冬季的平均感染率相對(duì)偏低,秋季、冬季的平均陽(yáng)性率分別為64.86%和75.36%。

表1 云南省不同地區(qū)豬場(chǎng)秋季PRRSV的PCR檢測(cè)結(jié)果Table1 The resu lts of PRRSV amplified by PCR in pig farms in different regions in autumn

表2 云南省不同地區(qū)豬場(chǎng)冬季PRRSV的PCR檢測(cè)結(jié)果Table2 The resultsof PRRSV amplified by PCR in pig farms in different regions in w inter

3 討論

近年來(lái),尤其是2006年中期后,PRRS以傳播迅速和高發(fā)病率、高病死率的流行病學(xué)特征在我國(guó)廣泛流行。本調(diào)查從云南省32個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集豬血液樣本進(jìn)行了PRRSV RT-PCR檢測(cè),采樣范圍基本含蓋了全省,且本次調(diào)查針對(duì)不同年齡豬,其所得結(jié)果更具有普遍性和代表性。

從不同生產(chǎn)用途分析,公豬PRRSV感染陽(yáng)性率為76.7%(46/60),母豬 73.4%(102/139),育肥豬60.2%(126/209)。相對(duì)而言,公豬陽(yáng)性率較母豬和育肥豬高。這可能是由于公豬一般不接種PRRS疫苗,PRRSV可以通過(guò)精液間斷性排出,而沒(méi)有臨床癥狀或處于亞臨床癥狀[8],公豬的PRRSV感染往往成為豬場(chǎng)疫病防制中容易忽視的環(huán)節(jié)。因此有必要加強(qiáng)公豬的免疫監(jiān)測(cè)與凈化工作,特別注意種公豬的對(duì)外引進(jìn)。此外,對(duì)本次PRRSV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的部分豬場(chǎng)進(jìn)行跟蹤調(diào)查,發(fā)現(xiàn)檢出陽(yáng)性病料的豬場(chǎng)中多數(shù)母豬有繁殖障礙情況,表明PRRSV感染已成為豬場(chǎng)中母豬發(fā)生繁殖障礙的主要原因。

斯特勞等[9]報(bào)道,各種品種、不同年齡和用途的豬均可感染,但以妊娠母豬和1月齡以內(nèi)的仔豬最易感。本次調(diào)查也得到了相似的結(jié)果,在不同生長(zhǎng)階段豬群中,仔豬陽(yáng)性率為78.5%(113/144),母豬73.4%(102/139),較育肥豬60.3%(126/209)陽(yáng)性率相對(duì)要高。

不同季節(jié)感染狀況調(diào)查結(jié)果表明,云南省冬季豬群PRRSV感染率相對(duì)秋季高。秋季、冬季的PRRSV感染平均陽(yáng)性率分別為64.86%、75.36%。這可能和云南獨(dú)特的氣候有關(guān)。云南氣候?qū)賮啛釒駶?rùn)季風(fēng)氣候類型,冬暖夏涼,是各種病毒孳生的溫床。

不同區(qū)域PRRSV感染調(diào)查調(diào)查結(jié)果表明,云南不同地區(qū)PRRS流行情況有一定差異性,其中,滇東最高為73%,其次滇南為72.7%,滇中為72.2%,滇西為67.2%,滇北為65.6%,這表明滇東地區(qū)是云南省PRRS的高發(fā)地區(qū)。這種差異可能與云南地理環(huán)境有關(guān)。云南氣候垂直變化十分明顯,而滇東大部分地區(qū)屬于亞熱帶和溫帶地區(qū),這樣適宜的氣候有利于PRRSV的生存。且東部交通運(yùn)輸便利,人流物流較頻繁,很容易形成病毒流通網(wǎng)。

近年來(lái)RT-PCR已廣泛應(yīng)用于畜禽傳染病的快速診斷。RT-PCR方法一般用于PRRSV組織病料(肺臟)的檢測(cè),本試驗(yàn)初步建立了從含毒量較少的血液和精液檢測(cè)PRRSV的RT-PCR方法,為更有效、經(jīng)濟(jì)、快捷的檢測(cè)PRRSV提供了參考。

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