何世成,劉道新,張 志,魯杏華,吳發(fā)興,鄒 敏,談志祥,郭成玲,張燕霞

(1.湖南省動物疫病預防控制中心,湖南長沙 410007;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心,山東青島 266034;3.湖南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所,湖南長沙 410007)

豬豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員,是導致斷乳后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原[1]。自1997年加拿大首次報道[2]以來,已在許多國家出現(xiàn)感染和流行。1999年朗洪武在北京、河北等地豬場中首次檢測到豬圓環(huán)病毒2型在我國的存在[3],此后國內(nèi)許多實驗室也相繼檢測、分離到該病毒,并進行很多相關研究[4-6]。

根據(jù)PCV致病性和核酸序列的不同,豬圓環(huán)病毒可分為PCV-1和PCV-2,PCV-1認為是PK-15細胞培養(yǎng)的污染物,無致病性,基因組全長1 759 bp,而PCV-2卻具有致病性,并已認為PCV-2是PMWS的主要病原,其基因組全長1 767 bp(或1 768 bp),PCV-1與PCV-2型內(nèi)同源性都在90%以上,但兩型間的同源性小于80%[7]。目前,PCV-2基因組序列相對穩(wěn)定,但分離自不同地區(qū)的毒株會有一定的差異。從湖南省2003年-2008年疑似PMWS病死豬組織中分離到7株PCV-2,并進行了全基因測序和遺傳進化分析,對湖南省6年來的PCV-2分子流行病學進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與試劑 病料為2003年-2008年湖南省內(nèi)疑似PMWS病死豬的組織(包括肺與淋巴結)。PK-15細胞、宿主菌 TG-1由農(nóng)業(yè)部動物檢疫所流行病研究中心實驗室提供;pMD 18-T Vector、r Taq 、dNTPs、DNA Marker、氨芐青霉素(Amp)、DNA膠純化回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。DNAzol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品。HindⅢ、Bam HⅠ內(nèi)切酶購自Promega公司。

1.1.2 引物 參考GenBank 2003年上海PCV2分離株全基因組序列(AY291318),利用DNA Star軟件包中的Primer Select軟件進行引物設計。

引物 1:5′-AACCTTAACCT T TCT TAT TC-3′

引物 2:5′-TTGAATTCTGGCCCTGCTCCC-3′

引物1、2擴增片段長 1 767 bp或1 768 bp,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,用前溶解于滅菌的TE(pH 8.0)中,稀釋至濃度為50 pmol/μ L,分裝保存于-20℃。

1.2 方法

1.2.1 病毒培養(yǎng) 將病死豬組織(肺與淋巴結)研磨粉碎(與PBS 1∶5),凍融3次,10 000 r/min離心10 min,取上清用氯仿抽提,除去具有囊膜的病毒。經(jīng)0.22 μ m濾器過濾后接種PK-15細胞,12 h后棄去培養(yǎng)液,用300 mmol/L的 D-氨基葡萄糖處理30 min,經(jīng)PBS洗滌后換上新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。連續(xù)盲傳4代,每次消化分瓶后12 h,均用300 mmol/L的D-氨基葡萄糖處理30 min。

1.2.2 病毒 DNA提取 每10 cm2細胞面上加1 mL DNA zol Reagent,搖動培養(yǎng)瓶以裂解細胞,小心將裂解物移入一離心管中,加入500 μ L無水乙醇,顛倒混勻,室溫放置5 min,DNA呈可見絮狀物析出,用滅菌槍頭小心將DNA挑至另一離心管,加入1 mL 750 mL/L的乙醇洗滌兩次,空干15 s后,緩慢加入200 μ L 8 mmol/L的 NaOH 溶液溶解DNA。置-20℃凍存?zhèn)溆?。?0 μ L用作PCR模板。

1.2.3 PCR擴增 所加PCR成份按試劑盒說明書,PCR擴增條件為95℃變性5 min;94℃1 min,54℃1 min,72℃2.5 min,35循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳,紫外光下觀察PCR擴增結果。

1.2.4 PCR擴增產(chǎn)物的克隆與酶切鑒定 PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖電泳后,切下含有目的條帶的瓊脂塊,用DNA膠純化回收試劑盒回收凝膠中的DNA 。取5 μ L膠回收產(chǎn)物與1 μ L pMD 18-T Vector和4 μ L Ligation Solution在4 ℃下連接過夜;按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化TG-1感受態(tài)細胞。

挑取白色菌落接種LB液體培養(yǎng)基,37℃震搖過夜。以堿裂解法小量堤取質(zhì)粒。用 HindⅢ、Bam HⅠ內(nèi)切酶雙酶切鑒定重組質(zhì)粒,以切出約為1.7 kb片段的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒。

1.2.5 測序分析 將陽性重組質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司測序。應用DNA Star軟件對序列進行分析比對。比對用序列來自GenBank,其中13株為PCV-2,2株為PCV-1(表1)。

表1 比對用GenBank序列Table 1 T he refered sequences of PCV isolates from GenBank

2 結果

2.1 病毒分離結果

從2003年-2008年,共分離獲得了7株PCV-2湖南株,分離時間和數(shù)量分別為2003年1株(HuN-03)、2005年 1株(HuN-05)、2006年 2株(HuN-0601、HuN-0602)、2007年 2株(HuN-0701、HuN-0702)、2008年1株(HuN-08)。每分離1株即進行基因組的克隆測序。

2.2 病毒基因組PCR擴增、克隆

對PK-15病毒培養(yǎng)液進行病毒基因組DNA的PCR擴增,將PCR擴增產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接,并轉(zhuǎn)化 TG-1感受態(tài)細胞,用 HindⅢ、Bam HⅠ雙酶切鑒定篩選陽性克隆。圖1和圖2是1株全基因組PCR擴增結果和陽性重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結果。

圖1 PCV-2分離株全基因組PCR擴增結果Fig.1 The amplified result of complete genome of PCV-2 isolate by PCR

圖2 陽性重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 Fig.2 Identification of the recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.3 PCV-2全基因組測序與基因組結構分析

7株湖南 PCV-2分離株全基因序列均為1 767 bp,都包括11個潛在的開放閱讀框(ORF),每個ORF的基因組定位與所編碼的多肽分子質(zhì)量如下:ORF1(51 nt～995 nt,35.8 ku),ORF2(1 033 nt～ 1 734 nt,27.8 ku),ORF3(357 nt～671 nt,11.9 ku),ORF4(386 nt～565 nt,6.5 ku),ORF5(1 016 nt～1 036 nt,0.76 ku),ORF6(1 521 nt～ 1 610 nt,3.0 ku),ORF7(1 681 nt～1 740 nt,2.0 ku),ORF8(688nt～753nt,2.4 ku),ORF9(1 731 nt～92 nt,4.5 ku),ORF10(1 523 nt～ 1 630 nt,4.2 ku)和 ORF11(989 nt～1 033 nt,1.8 ku),其中ORF1、ORF2是最大的兩個ORF,分別編碼復制相關蛋白(Rep蛋白)和病毒衣殼蛋白(CaP蛋白)。7株湖南PCV-2分離株基因組上都具有保守的莖環(huán)結構(5-GAAGTGCGCTGTAAGTAT TACCAGCGCACTTC-3)和9堿基基序(5-AAGTATTAC-3′),與其他PCV-2分離株一致。

2.4 PCV-2全基因組的序列比較與分析

將7株湖南PCV-2分離株與GenBank上的8株國內(nèi)PCV-2株、5株國外 PCV-2株、2株國內(nèi)PCV-1株序列進行比對分析,同源性分析結果顯示(圖3),我省7株 PCV-2株間同源性在94.9%～99.3%之間,與13株國內(nèi)外PCV-2基因組同源性在93.6%～99.7%之間,與2株PCV-1親緣關系較遠,同源性只有75.7%～76.5%。

遺傳進化樹(圖4)分析顯示,7株湖南分離株分屬4個進化方向,HuN-0601株與其他6株進化關系較遠,與所分析的8株國內(nèi)其他省份的毒株也沒有與其相同進化關系的毒株,與美國USA04和丹麥Denmark07毒株有較近的進化關系,表明該分離株可能為國外傳入,并且在國內(nèi)沒有成為主要流行基因型。HuN-03可能是其它5株遺傳演變的母本,它與上海SH04株同屬一個遺傳分支,顯示出其為我國早期PCV-2流行毒株的可能性。其他5株與所比較的大部分毒株都有較近的遺傳關系,但也可分為2個較獨立的進化方向,其中,HuN-05、HuN-0702、HuN-08在一個進化方向內(nèi),與美國USA08、澳大利亞 Aus08、韓國 Korea07、浙江 ZJ06、浙江ZJ07、廣東GD07、江蘇 JS04同屬一個分支,由于JS04株早在2004年就發(fā)表,表明了這一遺傳分支存在時間久,流行范圍廣,遺傳穩(wěn)定性高,提示該分支病毒為PCV2國際流行遺傳穩(wěn)定毒株;而HuN-07、HuN-0602與山東、湖北、北京的毒株同處一個遺傳分支,表現(xiàn)出國內(nèi)流行特性,分析其可能是一種國內(nèi)地域適應性流行毒株。

圖3 湖南PCV-2分離株同源性分析Fig.3 The homology analysis of the PCV-2 Hunan isolates

圖4 湖南省PCV-2毒株的遺傳進化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of PCV-2 complete genomes

3 討論

PMWS從一出現(xiàn)就呈現(xiàn)世界范圍內(nèi)的廣泛流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,引起了人們的普遍重視[8-9]。PCV-2作為引起PMWS的一種主要病原,也成為研究的焦點。目前研究表明,PCV-2為一種免疫抑制性病原,當其單獨感染時,僅能導致輕微的PMWS,但是當與 PRRSV、PRV、PPV或細菌等共同感染時,則會復制出典型的PMWS癥狀[10-11]。

本試驗從湖南省2003年-2008年疑似PMWS的病死豬組織中分離到7株PCV-2流行毒株,并對其進行了全基因組測序分析,結果顯示,湖南省7株PCV-2流行株基因組均為1 767 bp,未出現(xiàn)1 768 bp的毒株,基因組序列內(nèi)雖有多處點突變,但均未破壞11個潛在的ORF結構,都具有保守的莖環(huán)結構和9堿基基序,這兩個結構已證實與PCV-基因組滾環(huán)復制的起始有關,PCV-2中9堿基基序的第一個堿基由PCV-1中的T突變?yōu)锳,當該基序的前兩個堿基被改變時,病毒子的復制能力也隨之消失[12-13]。

7株湖南PCV-2病毒毒株間同源性在94.9%～99.3%之間,與GenBank中的13株 PCV-2基因組同源性在93.6%～99.7%之間,與PCV-1親緣關系較遠,同源性只有75.7%～76.5%,表明PCV-2有較穩(wěn)定的基因序列,且與PCV-1核酸序列相差較大。

對7株湖南PCV-2流行毒株進行遺傳進化關系分析,結果顯示,我省PCV-2流行毒株至少存在4種遺傳分支,一支可能是國外傳入但未形成主體,一支是省內(nèi)流行毒株的母本系,一支是國際流行核酸高度穩(wěn)定譜系,一支是地域適應性體系,從毒株分離時間判斷,現(xiàn)今湖南省流行的PCV-2毒株基本為后兩支遺傳譜系毒株。本次的分析方向與結果在國內(nèi)尚屬首次,與其他學者不一致的原因可能在于所選比較毒株不同所致。

[1]A llan G M,McNeily F,Kennedy S,et al.Isolation of porcine circovirus-like virus from pigs with a wasting disease in the USA and Europe[J].J Vet Diagn Invest,1998,10:3-10.

[2]A llan G M,Eills J A.Porcine circovirus:a review[J].J Vet Diagn Invest,2000,12(1):3-14.

[3]郎洪武,張廣川,吳發(fā)權,等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測[J].中國獸醫(yī)科技,2000,30(3):3-5.

[4]周繼勇,陳慶新,葉菊秀,等.豬圓環(huán)病毒2型感染的血清學分析[J].中國獸醫(yī)學報,2004,24(1):1-3.

[5]王貴平,將智勇,宋長緒,等.豬 2型圓環(huán)病毒廣東分離株的全基因組克隆及序列分析[J].中國預防獸醫(yī)學報,2004,26(4):248-251.

[6]秦曉冰,金寧一,鄭 敏,等.豬圓環(huán)病毒2型內(nèi)蒙古株全基因組的克隆及序列分析[J].中國獸醫(yī)學報,2004,24(4):352-354.

[7]Cheung A K,Bolin S R.Kinetics of porcine circovirus type 2 replication[J].A rch Virol,2002,147(1):43-58.

[8]Allan G M,McNeilly F,Meehan B M,et al.Isolation and characterisation of circoviruses from pig s with wasting syndromes in Spain,Denmark and Northern Ireland[J].Vet Microbiol,1999,66(2):115-123.

[9]Morozov I,Sirinarumitr T,Sorden S D,et al.Detection of a novel strain of porcine circovirus in pig s with postweaning multisy stemic wasting syndrome[J].J Clin Microbiol,1998,36(9):2535-2541.

[10]馮志新,姜 平,王先煒,等.PRRSV與 PCV2體外共感染對豬肺泡巨噬細胞免疫學功能的影響[J].中國預防獸醫(yī)學報,2007,29(12):950-955.

[11]楊漢春.豬免疫抑制性疾病的流行特點與控制對策[J].中國畜牧獸醫(yī),2004,31(5):41-43.

[12]M ankertz A,Persson F,M ankertz J,et al.M apping and characterization of the origin of DNA replication of porcine circovirus[J].J Gen Virol,1997,71(3):2562-2566.

[13]M ankertz A,Hillenbrand B.Replication of po rcine circovirus type 1 requires two protein encoded by the viral rep gene[J].Virology,2001,279(2):429-438.