沈明華,莫重輝,趙寶玉,王占新

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海西寧 810006;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵 712100)

棘豆是我國草原上對家畜危害最為嚴重的毒草之一,也是目前世界范圍危害草原畜牧業(yè)發(fā)展最嚴重的毒草[1]。我國西北、西南及華北9個省(區(qū))都發(fā)生過家畜棘豆中毒,棘豆種類超過20種,危害大且造成較大毒性災(zāi)害的主要有甘肅棘豆(Oxytropis kansuensis)、小花棘豆(O.glabra)黃花棘豆(O.ochrocephala)、冰川棘豆(O.glacialis)、寬苞棘豆(O.latiracteata)、急彎棘豆(O.def lexa)等,其分布面積超過800萬hm2,每年因棘豆中毒所造成的經(jīng)濟損失高達10億元以上,為我國的“三大毒草災(zāi)害”之一。棘豆不僅引起動物大批死亡,而且嚴重影響動物的繁殖機能,造成母畜不孕、流產(chǎn)、胎兒畸形,公畜性欲減退、精液品質(zhì)下降等,妨礙畜種改良工作,已嚴重制約我國草原畜牧業(yè)的發(fā)展。前期研究證實,甘肅棘豆的主要毒性成分是苦馬豆素(swainsonine)[2],其最初是由Colegate S M 等[3]從灰苦馬豆(Swainsine canecens)中分離而命名,我國學(xué)者曹光榮等[4]首次從黃花棘豆中分離到主要有毒成分苦馬豆素?，F(xiàn)代毒理學(xué)研究表明,甘肅棘豆引起家畜中毒的機理是其主要有毒成分苦馬豆素抑制了機體α-甘露糖苷酶的活性,引起體內(nèi)低聚糖障礙而發(fā)生積聚,導(dǎo)致神經(jīng)及內(nèi)臟細胞廣泛的空泡變性,尤以小腦神經(jīng)元細胞、肝細胞、腎臟近曲小管上皮細胞和腎上腺皮質(zhì)部球狀帶與髓質(zhì)部上皮細胞空泡變性最為明顯[5-10],從而使家畜表現(xiàn)為以神經(jīng)機能障礙為特征的慢性中毒癥狀。顧百群等[11]、王凱等[12]分別觀察了甘肅棘豆對山羊和綿羊的組織病理學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)山羊和綿羊的腦、腎、肝、腎上腺、脾臟、淋巴等臟器都出現(xiàn)明顯的空泡變性。王凱等[13]、李勤凡等[14]分別給實驗家兔每天按每千克體重10 g劑量飼喂黃花棘豆和冰川棘豆,待出現(xiàn)典型中毒癥狀后,進行組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),家兔心、肝、脾、肺和腎等組織細胞普遍出現(xiàn)空泡變性。然而有關(guān)甘肅棘豆對實驗家兔的組織病理學(xué)變化尚未報道,本試驗通過復(fù)制家兔實驗性甘肅棘豆中毒模型,研究不同劑量甘肅棘豆對家兔組織學(xué)的影響,為甘肅棘豆毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 甘肅棘豆 甘肅棘豆地上部分全草2008年8月采于青海省湟源縣日月鄉(xiāng),采時正值盛花期,曬干后運回粉碎備用。植物標本由青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院草業(yè)科學(xué)系孫海群教授鑒定。

1.1.2 實驗動物 家兔 18只,體重 1.8 kg～2.3 kg,雌雄各半,購自于青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實習牧場。試驗前內(nèi)服左旋咪唑3 mg/kg·w驅(qū)蟲,臨床觀察2周,確認為臨床健康后方可開始試驗。

1.1.3 主要儀器與試劑 820型切片機,德國生產(chǎn);904型磨刀機,美國生產(chǎn);872型定時定溫烤片臺,浙江義烏生化儀器廠生產(chǎn);Olympus Bx51型光學(xué)顯微鏡,日本生產(chǎn);Olympus C3040-ADU型數(shù)碼相機,日本生產(chǎn);Olympus DP70型圖象采集系統(tǒng),日本生產(chǎn);YP1200型電子天平,上海第二天平儀器廠生產(chǎn);DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn);100 mL/L的中性福爾馬林溶液、Ehrlich蘇木素染液、10 g/L伊紅染液、不同濃度酒精、二甲苯,均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物的分組與處理 18只家兔隨機分成3組即Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組,每組6只,雌雄各半,試驗前空腹稱重,定為基礎(chǔ)體重。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組實驗家兔分別按每日1、5、10 g/kg的劑量飼喂自配的甘肅棘豆草顆粒飼料(棘豆草粉40%、麥子15%、玉米15%、豆粕 15%、麩皮 14.5%、食鹽0.5%),待采食完畢后,再添加基礎(chǔ)日糧及少量干草,自由飲水。

1.2.2 基礎(chǔ)日糧組成 基礎(chǔ)日糧參照法國AEC(1987)家兔飼養(yǎng)標準,以玉米、麩皮、豆粕、玉米秸為主要原料,再補充骨粉、石粉、食鹽、預(yù)混料、蛋氨酸等精確配制而成,基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平Table 1 T he basal ration formulation and nutrition level

1.2.3 臨床癥狀與病理學(xué)觀察 每天觀察各試驗組家兔的飲食狀態(tài)、精神狀態(tài)、運動行為、排糞排尿等情況。每兩周末稱量各組實驗家兔的體重。于連續(xù)飼喂甘肅棘豆草顆粒飼料的第120天,捕殺各試驗組家兔,觀察大體解剖變化,同時采取心、肝、肺、腎、大腦、小腦、淋巴結(jié)置于100 mL/L的中性福爾馬林溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋,間隔連續(xù)切片,H.E染色,光鏡觀察病理組織學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

在飼喂甘肅棘豆顆粒飼料后第18天,Ⅲ組1只懷孕母兔發(fā)生流產(chǎn);Ⅱ和Ⅲ組試驗家兔在第35天開始表現(xiàn)為精神沉郁、食欲輕度減退、反應(yīng)較遲鈍、后肢無力,喜臥等臨床表現(xiàn);Ⅰ組試驗家兔在整個試驗期間沒有出現(xiàn)異常表現(xiàn)。

2.2 體重變化

由圖1可見,Ⅰ組試驗家兔僅在試驗第42～70天時體重明顯增加(P＜0.05或P ＜0.01);Ⅱ組、Ⅲ組試驗家兔在整個試驗期內(nèi)體重與試驗前比較均顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)。

圖1 各試驗組家兔體重變化Fig.1 Weight changes of rabbits in each group

2.3 病理學(xué)變化

2.3.1 大體剖檢變化 Ⅰ組實驗家兔的脾臟稍腫大,心臟、肝臟、腎臟等組織器官未見明顯的眼觀變化。Ⅱ組實驗家兔的脾臟腫大,肝臟脆性增加,膀胱中尿液渾濁,其它器官未見到明顯的肉眼變化。Ⅲ組實驗家兔的脾臟明顯腫脹,質(zhì)地極度柔軟;肝臟腫大,呈土黃色;肺臟氣腫、呈蒼白色、被摸緊張、邊緣鈍圓、有點狀出血;右心室明顯擴張、質(zhì)地柔軟、心室壁變薄;頭蓋骨疏松、脆性增大;腎臟輕微腫脹、切面稍外翻、被膜不易剝離。

2.3.2 病理組織學(xué)變化

(1)肝臟。Ⅰ組實驗家兔肝細胞輕微腫大,肝竇狀隙輕度變狹窄(圖2A);Ⅱ組實驗家兔肝細胞輕度腫大,顆粒變性,肝竇狀隙明顯變狹窄(圖2B);Ⅲ組實驗家兔肝小葉界限不清,肝竇隙變狹窄或閉塞,肝細胞索紊亂,并發(fā)生廣泛嚴重的顆粒變性和空泡變性(圖2C)。

圖2 家兔肝臟病理組織學(xué)變化Fig.2 T he histopatholoical lesions in rabbit liver

(2)腦。Ⅰ組實驗家兔腦血管周圍間隙輕度增寬(圖3A);Ⅱ組實驗家兔部分小腦浦肯野氏細胞核溶解或消失,發(fā)生空泡變性(圖3B);Ⅲ組實驗家兔大腦血管擴張充血,血管周圍間隙增寬,神經(jīng)細胞核濃縮,溶解或消失,而發(fā)生空泡變性,可以看到衛(wèi)星現(xiàn)象和噬神經(jīng)現(xiàn)象。小腦浦肯野氏細胞大小和著色不一,胞漿內(nèi)有細小的顆粒,細胞核壞死、溶解、消失,有空泡變性(圖3C)。

圖3 家兔小腦病理組織學(xué)變化Fig.3 The histopatholoical lesions in rabbit cerebella

(3)肺臟。3組實驗家兔均表現(xiàn)肺充血,肺泡壁增生,間質(zhì)增生,肺泡毛細血管上皮細胞濃縮、碎裂、溶解,肺泡壁斷裂,肺泡增大(圖4A、圖4B和圖4C)。

圖4 家兔肺臟病理組織學(xué)變化Fig.4 The histopatholoical lesions in rabbit lungs

(4)腎臟。Ⅰ組實驗家兔腎小球囊腔稍變狹窄,細胞核從基底膜上脫落、溶解,腎小管上皮細胞腫大發(fā)生空泡變性(圖5A);Ⅱ組實驗家兔腎小球體積稍增大,有輕度充血,腎小球囊腔變狹窄,腎小球部分血管壁上皮細胞輕度增生,發(fā)生顆粒變性,細胞從基底膜上脫落、溶解(圖5B);Ⅲ組實驗家兔腎小球體積增大、充血、腎小球囊腔變狹窄,腎小球血管壁上皮細胞增生,腎小管上皮細胞腫大發(fā)生顆粒變性、空泡變性、細胞破裂、管腔狹窄或阻塞、細胞核從基底膜上脫落、溶解、形成細胞管型、髓質(zhì)部血管充血,間質(zhì)增生(圖5C)。

圖5 家兔腎臟病理組織學(xué)變化Fig.5 The histopatholoical lesions in rabbit kidney

(5)脾臟。Ⅰ組實驗家兔纖維素樣變性,脾竇內(nèi)有大量紅細胞;Ⅱ組實驗家兔脾竇內(nèi)聚集了大量紅細胞,脾小梁增生;Ⅲ組實驗家兔被膜增厚,纖維素樣變性,脾小梁增生,脾小體數(shù)量減少,脾竇內(nèi)有大量紅細胞。

(6)心肌。Ⅰ組實驗家兔心肌部分橫紋消失,其他未見明顯病理變化;Ⅱ組實驗家兔心肌部分橫紋消失,心肌細胞顆粒變性;Ⅲ組實驗家兔心肌纖維上有空泡,心肌部分橫紋消失,心肌細胞顆粒變性,部分細胞較淡染,間質(zhì)內(nèi)有漿液性滲出液和纖維素性滲出液。

(7)淋巴結(jié)。Ⅰ組實驗家兔未見明顯病理變化;Ⅱ組實驗家兔小梁增生,淋巴竇內(nèi)有較多的淋巴細胞;Ⅲ組實驗家兔皮質(zhì)淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)不明顯,小梁增生,淋巴竇內(nèi)有大量的淋巴細胞、單核細胞、纖維素滲出,以及少量含鐵血黃素沉著。

(8)腸。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組實驗家兔均未見明顯病理變。

3 討論

我國學(xué)者普遍認為甘肅棘豆中主要有毒成分為苦馬豆素,其中毒機理主要是苦馬豆素具有抑制動物體內(nèi)α-甘露糖苷酶活性的作用,使體內(nèi)的低聚糖在細胞內(nèi)蓄積,導(dǎo)致細胞特別神經(jīng)細胞發(fā)生空泡變性[11,15],從而表現(xiàn)為以中樞機能紊亂為特征的中毒癥狀。顧百群等[11]按10 g/kg劑量經(jīng)瘤胃瘺管給山羊投服甘肅棘豆粉,當受試羊出現(xiàn)典型的中毒癥狀后,病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)山羊腦、肝、腎、心、胰等臟器有不同程度的損害作用,主要以細胞的空泡化變性為特征。從本試驗組織病理學(xué)觀察可以看出,實驗家兔的心、肝、肺、腎、大腦、小腦、淋巴結(jié)均有不同程度的損傷,特別是腦變化較明顯,而且甘肅棘豆的劑量越大這種損傷越明顯,其組織學(xué)病理變化主要以神經(jīng)細胞廣泛性空泡變性為特征,這和顧百群等山羊甘肅棘豆中毒后組織學(xué)病理變化描述的相似,但沒有山羊明顯,這可能是山羊?qū)Ω拭C棘豆的敏感性比實驗家兔高有關(guān)。

我國學(xué)者分別從甘肅棘豆、黃花棘豆、冰川棘豆等棘豆屬植物中分離出苦馬豆素,含量分別為0.021%、0.012%、0.002%[4、16-17]。王凱等[13]、李勤凡等[14]報道家兔分別按每日10 g/kg飼喂黃花棘豆和冰川棘豆草粉后,實驗家兔40 d后均出現(xiàn)棘豆中毒癥狀,心、肝、肺、腎、大腦、小腦、淋巴結(jié)均有不同程度的損傷,特別是腦變化較明顯。本試驗中實驗家兔分別按每日1、5、10 g/kg劑量飼喂甘肅棘豆草顆粒后,Ⅱ組、Ⅲ組實驗家兔在試驗第35天開始出現(xiàn)的甘肅棘豆中毒癥狀,上述器官組織也有不同程度的損傷,和王凱等、李勤凡等報道描述的相似,但本試驗中Ⅱ組、Ⅲ組實驗家兔甘肅棘豆中毒癥狀明顯比家兔黃花棘豆和冰川棘豆中毒癥狀出現(xiàn)的時間提前,這可能甘肅棘豆中主要有毒成分苦馬豆素含量比黃花棘豆和冰川棘豆高有關(guān),這也可從甘肅棘豆引起的組織學(xué)病理變化比黃花棘豆和冰川棘豆引起的組織學(xué)病理變化明顯支持上述觀點。Ⅰ組實驗家兔沒有出現(xiàn)異常變化,但組織器官受到一定程度的損傷,說明給實驗家兔按每日1 g/kg劑量飼喂甘肅棘豆后,對實驗家兔具有一定的毒性作用。

丁伯良等[2]對 9只懷孕關(guān)中奶山羊按每日10 g/kg體重劑量飼喂甘肅棘豆粉,孕羊在飼喂甘肅棘豆后第10～43天全部陸續(xù)流產(chǎn),流產(chǎn)的為弱羔、死胎、畸胎或腐敗胎,組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)卵巢黃體細胞、卵泡細胞和胎盤滋養(yǎng)層細胞胞漿廣泛性空泡變性,而且從中毒懷孕羊胎水和胎盤中檢測出苦馬豆素,證明苦馬豆素能損害胎盤并通過胎盤屏障直接損害胎兒。本試驗中在飼喂甘肅棘豆顆粒飼料后第18天Ⅲ組1只懷孕母兔發(fā)生流產(chǎn),這是否也是甘肅棘豆中主要有毒成分苦馬豆素損害胎盤并通過胎盤屏障直接損害胎兒引起的,還有待于進一步深入研究。

劉詡中等[18]對甘肅棘豆營養(yǎng)成分進行了測定,結(jié)果表明甘肅棘豆中粗蛋白含量為13%～16%,與優(yōu)質(zhì)苜蓿營養(yǎng)價值(優(yōu)質(zhì)苜蓿粗蛋白含量為15%)相當,粗纖維含量24%～27%,與苜蓿粉相近,Ca、P含量也較高,由此可見,甘肅棘豆具有豐富的營養(yǎng)價值。李建科等[19]報道,當甘肅棘豆添加劑量為每千克體重24 g時,小鼠臨床反應(yīng)、體增重、食物利用率及血液學(xué)指標等未出現(xiàn)明顯變化,說明此劑量為甘肅棘豆對小鼠的最大無作用劑量;王凱等[20]報道將甘肅棘豆粉按每千克體重10 g給實驗羊進行間歇飼喂(間歇兩周),實驗羊在70 d內(nèi)未出現(xiàn)任何甘肅棘豆中毒癥狀(對照組實驗羊18 d開始出現(xiàn)甘肅棘豆中毒癥狀),說明間歇兩周飼喂甘肅棘豆可以較好地預(yù)防羊甘肅棘豆中毒的發(fā)生,同時還能利用甘肅棘豆的營養(yǎng)成分;楊具田等[21]將甘肅棘豆劑量控制在日糧10%以內(nèi)飼喂肥育豬,在整個試驗期內(nèi)未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)或中毒癥狀,屠宰后未發(fā)現(xiàn)異常,肥育豬血液學(xué)指標也沒有變化,表明甘肅棘豆作為雜食動物的飼料,添加量控制在日糧10%以內(nèi)是安全的。從本試驗實驗家兔體重變化來看,Ⅱ組、Ⅲ組實驗家兔體重與試驗前比較都有所增加(P＜0.05或P＜0.01),和上述資料報道相似,但Ⅰ組僅在試驗第42～70天時體重明顯增加(P＜0.05或P＜0.01),說明隨著甘肅棘豆攝入量的增加,體重增加,劑量效應(yīng)明顯。同時從甘肅棘豆中毒癥狀出現(xiàn)的時間、中毒程度、體重變化等可以看出實驗家兔對甘肅棘豆具有一定的耐受性,這也為甘肅棘豆作為嚙齒動物飼料開辟一個新的途徑。

致謝:本試驗承蒙莫重輝副教授及梁林、拉毛、張旦梅、郭霞霞、劉冰存、晁永亮等同志的大力協(xié)助,在此表示衷心感謝!

[1]吳 達,梁 冰,師彥平,等.甘肅棘豆研究進展[J].中國草食動物,2003,23(1):37-38.

[2]丁伯良,王建辰,薛登民,等.甘肅棘豆及中毒奶山羊尿液、胎水、胎兒胎盤中苦馬豆素的檢驗[J].草地學(xué)報,1994,2(2):66-73.

[3]Colegate S M,Dorling P R,Huxable C R A.Spectroscopic investigation of swainsonine:an α-mannosidase inhibitor isolated from swainsine canecens[J].Aust J Chem,1979,(32):2257-2264.

[4]曹光榮,李紹君,段得賢,等.黃花棘豆有毒成分的分離與鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1989,17(3):1-7.

[5]張 潔.瘋草中毒研究概況及進展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,1994(1):46-48.

[6]顧百群.山羊甘肅棘豆臨床病理學(xué)研究[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1990(9):622-681.

[7]薛登民.羊黃花棘豆中毒病理學(xué)變化報告[J].動物毒物學(xué),1989(1):392-421.

[8]Panter K E,James L F,Hartley W J.T ransient testicular degeneration in rams fed locoweed(Astragalus lentiginosus)[J].Vet Human T oxi,1989,31(1):422-461.

[9]M oly neux R J,James L F.Loco intoxication:indolizidine alkaloids of spotted locoweed(Astragalus lentiginosus)[J].Science,1982,216(4542):1902-1911.

[10]van Kampen K R,James L F.Pathology of locoweed poisoning in sheep[J].Path Vet,1969(6):4132-4231.

[11]顧百群,段得賢,崔中林,等.山羊?qū)嶒炐愿拭C棘豆中毒的臨床病理學(xué)研究[J].動物毒物學(xué),1990,5(1/2):6-10.

[12]王 凱,楊 枝,王存壽.綿羊?qū)嶒炐愿拭C棘豆中毒的病理學(xué)研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,1995,15(4):390-392.

[13]王 凱,何寶祥,羊秀措.家兔實驗性黃花棘豆中毒的臨床及病理學(xué)觀察[J].中國獸醫(yī)科技,1995,25(2)26-27.

[14]李勤凡,王建華,耿果霞,等.冰川棘豆對家兔的毒性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2004,35(6):716-719.

[15]王 凱,曹光榮,段得賢,等.黃花棘豆對山羊的毒性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,1990,21(1):80-86.

[16]趙寶玉.瘋草(甘肅棘豆)生物堿系統(tǒng)分析及其毒性的比較病理學(xué)研究[D].陜西楊陵:西北農(nóng)林科技大學(xué),2001.

[17]童德文,曹光榮,耿果霞,等.薄層掃描測定5種瘋草中苦馬豆素含量[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2003,23(2):183-184.

[18]劉詡中,盧健雄,楊具田,等.甘肅棘豆毒性及其營養(yǎng)價值評定[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2002(2):46-47.

[19]李建科,劉詡中,盧健雄,等.甘肅棘豆飼喂小白鼠的亞慢性毒性效應(yīng)及安全利用研究[J].中獸醫(yī)科技,1995,25(8):28-30.

[20]王 凱,莫重輝,趙寶玉,等.甘肅棘豆間歇飼喂對綿羊的毒性研究[J].畜牧與獸醫(yī),1998,30(3):125-126.

[21]楊具田,李建科,盧健雄,等.甘肅棘豆草粉對育肥豬的效果好毒性試驗[J].中國獸醫(yī)科技,1997,27(5):30-31.