曹晶萍, 魏曉晴，趙 瑩, 崔 穎，高 穎,2

(1.遼寧省醫(yī)學(xué)細(xì)胞分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116044； 2.大連醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 遼寧 大連 116044)

目前，已有很多文獻(xiàn)報(bào)道HPLC法測(cè)定各種藥品中大黃素的含量，但少見(jiàn)人體血清中大黃素濃度的測(cè)定方法。為分析大黃素在人體血清中濃度及藥動(dòng)學(xué)規(guī)律，本文參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-5]，建立了高效液相色譜法測(cè)定人體血清中大黃素的分析方法，報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Waters1525型高效液相色譜儀，Wsters2487紫外檢測(cè)器，Breeze色譜管理系統(tǒng)，UNIVERSAL 30RF高速冷凍離心機(jī)，XH-C型旋渦混合器。大黃素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0756-200211)，甲醇為國(guó)產(chǎn)色譜純，磷酸為國(guó)產(chǎn)分析純，超純水經(jīng)微孔濾膜濾過(guò)后使用。

1.2 方 法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：Nova-Pak C18 (3.9 mm×150 mm，4 μm)。流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)，流動(dòng)相均以0.45 μm濾膜過(guò)濾，超聲脫氣后使用。流速1.0 mL/min，柱溫37℃。紫外檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液與標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱(chēng)取大黃素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解稀釋配成含大黃素1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，充氮?dú)夂蠓庞?80℃低溫冰箱保存。取大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)用甲醇稀釋成濃度分別為0.1、5、10、15、20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)用液。

1.2.3 樣品的測(cè)定：取8名健康志愿者血清200 μL，置于2.0 mL帶蓋塑料離心管中，加入800 μL乙醚，放至旋渦混合器上震蕩15 min后， 然后以-4 ℃，12000 g離心10 min。 準(zhǔn)確吸取上層乙醚提取液400 μL移入另一2.0 mL帶蓋塑料離心管中。通氮?dú)鈱⑻崛∫簱]發(fā)干后，立即加入100 μL甲醇并蓋上蓋子，在旋渦混合器上震蕩溶解，使殘留物溶于甲醇，-4℃，12000 g離心10 min，用微量進(jìn)樣器吸取20 μL上清液進(jìn)樣分析。

1.2.4 加樣回收率及精密度實(shí)驗(yàn)：用正常人血清適量，準(zhǔn)確加入大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品測(cè)定方法操作分析，每批樣品同一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，同批樣品連續(xù)測(cè)定5 d。將峰面積差值代入回歸方程并計(jì)算回收率和精密度

2 結(jié) 果

2.1 色譜分離

選用254 nm檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，大黃素有較大吸收值，并且能與其他峰有效地分離。標(biāo)準(zhǔn)溶液和血清樣本中大黃素的保留時(shí)間為4.65 min。見(jiàn)圖1。

圖1 大黃素在血清中的色譜行為A 為標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖；B 為人體血清中大黃素色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

取標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)用液分別進(jìn)樣測(cè)定，以濃度(X)對(duì)樣品的峰面積(Y)進(jìn)行回歸，求得回歸方程：Y=4.36e+004X+3.22e+005，相關(guān)系數(shù)r=0.9993。以基線噪音3倍峰面積對(duì)應(yīng)的大黃素含量作為最底檢出限20 ng/mL。

2.3 加樣回收率及精密度

平均回收率為99.01%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.16%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.78%。

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

取8名健康志愿者含大黃素血清，按照樣品測(cè)定方法操作，以外標(biāo)法計(jì)算大黃素的血清藥物濃度分別為2.55、2.16、 2.09、 2.06、 1.98、 1.96、 1.80、 1.51 μg/mL，平均值為2.01 μg/mL。

3 討 論

大黃素(Emodin)，化學(xué)名，1'3'8-三羥基-6-甲基蒽醌，分子量為270.23，來(lái)源為蓼科植物虎杖的干燥根莖和根， 掌葉大黃的根莖， 橙黃色長(zhǎng)針狀結(jié)晶。 口服大黃素在腸內(nèi)易于吸收，2～3 h后血中即達(dá)最高濃度，以后慢慢下降，亦有人把它制成注射劑，用于肌肉和靜脈注射。在臨床上，用大黃素純品治療腫癌，主要用于白血病、胃癌等腫瘤，而最常用的則用于抑菌。因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏、穩(wěn)定的人血清中大黃素的測(cè)定方法很有必要。

本實(shí)驗(yàn)分別使用乙醚[1]、正己烷、氯仿[2-5]為提取劑，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，用乙醚提取的樣品提取回收率明顯高于其他兩種有機(jī)試劑，且考慮到乙醚易揮發(fā)且毒性較小，故選乙醚作為提取劑。流動(dòng)相選擇為甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)，甲醇與0.1%磷酸溶液的比例對(duì)保留時(shí)間和分離度有影響，經(jīng)實(shí)驗(yàn)選擇兩者比例為80∶20可得到較好的分離效果及合適的保留時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)研究了國(guó)內(nèi)外各種方法的優(yōu)點(diǎn)，建立了高效液相色譜法測(cè)定人體血清中大黃素的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明被測(cè)組分大黃素峰形對(duì)稱(chēng)，無(wú)拖尾現(xiàn)象，無(wú)干擾，精密度也較理想，而且具有快速、靈敏、準(zhǔn)確和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，故適用于人體血清中大黃素濃度的測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)、生物利用度研究。

[1] 李蘭芳，張勤增，解麗君，等.通脈活血膠囊中大黃素在大鼠血漿中的濃度及藥代動(dòng)力學(xué)研究[J]. 河北醫(yī)藥，2006，28(11)：1020-1022.

[2] 林志強(qiáng). 高效液相色譜法快速測(cè)定養(yǎng)血安神糖漿中大黃素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12(11)：26-27.

[3] 袁華峰. HPLC法測(cè)定肝炎合劑中大黃素的含量[J].藥學(xué)與臨床研究，2008，16(2)：155-156.

[4] 王曉宏. HPLC法測(cè)定護(hù)肝寧膠囊中大黃素[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2008，22(3)：44-45.

[5] 林瑞紅.高效液相色譜法測(cè)定降脂寧片中大黃素的含量[J]. 中藥材，2008，31(2)：306-308.