于 琦，孟秀香，袁 宏，王 楠，姜艷梅 ，馬末嬌

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044； 2.泰山醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，山東 泰安 271016； 3.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116011； 4.中國人民解放軍第210醫(yī)院,遼寧 大連 116013)

癌基因Bmi-1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1)是轉(zhuǎn)錄抑制因子Polycomb group(PcG)家族中的一員，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)控中起著極其重要的作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Bmi-1基因在多種腫瘤如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等腫瘤組織中異常高表達(dá)，并參與惡性腫瘤的進(jìn)展，這可能是腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)[1-4]。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的探討基因表達(dá)的有效手段。與傳統(tǒng)的mRNA定量方法如Northern blot、競爭PCR、RT-PCR半定量檢測等技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR具有操作簡便、快速高效的特點(diǎn)，而且具有更高的靈敏度和特異性，能夠?qū)RNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量[5]。本研究將定量RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于Bmi-1基因表達(dá)的檢測，建立了靈敏、快速、可靠的定量檢測Bmi-1 mRNA表達(dá)的方法，并用此方法檢測白血病患者及健康人外周血標(biāo)本中Bmi-1基因的表達(dá)，以探討B(tài)mi-1基因在急性白血病細(xì)胞中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

26例急性髓系白血病初診患者的外周血EDTA抗凝標(biāo)本來自中國人民解放軍第210醫(yī)院，其中M25例，M39例，M44例，M58例。正常對照為10例健康人EDTA抗凝外周血。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol及逆轉(zhuǎn)錄試劑購自Invitrogen公司，pMD18-T simple 載體購自大連寶生物公司，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑購自大連寶生物公司，LightCycler 定量PCR擴(kuò)增儀及專用毛細(xì)管由Roche公司提供，實(shí)驗(yàn)所用的引物均由大連寶生物公司合成。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

依據(jù)Genebank收錄的Bmi-1基因與GAPDH基因mRNA全序列，設(shè)計(jì)特異性引物，兩種基因的上下游引物均跨越內(nèi)含子，以避免基因組DNA的污染。Bmi-1：上游引物5′-TCATCCTTCTGCTGATGCTG-3′，下游引物5′-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3′，擴(kuò)增片段長度221 bp；GAPDH：上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC -3′，擴(kuò)增片段長度226 bp。

1.4 細(xì)胞總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

Trizol法從人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞、白血病及健康人外周血中提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量及濃度。取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，步驟按操作說明書進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用于PCR反應(yīng)。

1.5 Bmi-1及GAPDH定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

取cDNA 2 μL，用Bmi-1及GAPDH 的上下游引物于PCR儀上擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2 min,94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,30個(gè)循環(huán)，72℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒回收，與pMD18-T simple 載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)基中生長的菌落，提取質(zhì)粒初步鑒定，陽性克隆進(jìn)一步測序分析證實(shí)(由大連寶生物公司完成)。將篩選出的陽性菌株擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，準(zhǔn)確定量后10倍系列稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)品，-20℃保存。

1.6 實(shí)時(shí)定量方法檢測Bmi-1 mRNA

將含有Bmi-1和GAPDH基因的質(zhì)粒10倍系列稀釋，分別制備107、106、105、104、103copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品，以上述稀釋物及陰性對照分別做熒光定量PCR。反應(yīng)體系 (共20 μL)：SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL，上、下游引物各0.4 μL， DNA模板2.0 μL，dH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s；95℃ 5 s,60℃ 20 s,45個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增完畢后進(jìn)行融解曲線分析。反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及融解曲線。根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由軟件自動計(jì)算待測樣本中Bmi-1含量。為消除標(biāo)本處理、逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)差異,以Bmi-1 mRNA 和內(nèi)參GAPDH mRNA 含量比值作為評價(jià)Bmi-1 mRNA表達(dá)水平指標(biāo)。

1.7 特異性檢測

擴(kuò)增結(jié)束后觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線是否為單峰；另取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否為單一條帶。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Bmi-1基因與GAPDH基因片段的克隆

普通RT-PCR 擴(kuò)增 Bmi-1基因及GAPDH基因片段的產(chǎn)物分別為221 bp和226 bp,克隆入pMD18-T simple 載體，經(jīng)測序證實(shí),與基因庫序列一致。

2.2 Bmi-1及GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍系列稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為樣本，經(jīng)實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增后，以Ct值為縱坐標(biāo)，以不同濃度拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，建立了Bmi-1及GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1、2)。實(shí)時(shí)熒光定量檢測系統(tǒng)計(jì)算出Bmi-1和GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均為-1.00，斜率分別為-4.294和-5.054，最低可檢驗(yàn)1×103copies/μL。

圖1 GAPDH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 Bmi-1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 方法的特異性

熔解曲線分析發(fā)現(xiàn)Bmi-1和GAPDH的PCR產(chǎn)物均呈較為銳利的單一峰 ( 圖3、4) ,Tm分別為80.4℃和84.4℃。熔解曲線中沒有其他雜峰出現(xiàn)，可知在用SYBR GreenⅠ熒光染料進(jìn)行PCR檢測時(shí)，熒光信號全部為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，沒有其他干擾。

圖3 Bmi-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線

圖4 GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線

不同模板濃度的定量PCR產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠電泳呈單一條帶 (圖5、6) ,靶基因Bmi-1與內(nèi)參基因GAPDH的PCR產(chǎn)物分別呈位于221 bp和226 bp左右，且無其他雜帶，這進(jìn)一步驗(yàn)證了反應(yīng)的特異性。

圖5 Bmi-1定量PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

Lane 1：DL2000；Lane 2：陰性對照；Lane 3～7：107～103拷貝/μL質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物

圖6 GAPDH定量PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

Lane 1：DL2000；Lane 2：陰性對照；Lane 3～7：107～103拷貝/μL質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4 Bmi-1 mRNA在急性白血病初診患者及健康人外周血中的表達(dá)

Bmi-1 mRNA在10例健康人外周血中的相對表達(dá)量為0.19±0.08，而在26例初診急性白血病患者外周血表達(dá)量為0.56±0.12，與對照組的表達(dá)量相比，差異有顯著性意義(P<0.05)。

3 討 論

Bmi-1是1991 年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，該基因位于人10 p13，含有10個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。人類Bmi-1 cDNA全長3251 bp，其開放閱讀框編碼的蛋白含有326個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為44～46 kD。Bmi-1屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子polycomb group家族，通過抑制下游靶點(diǎn)(Ink4a/ARF位點(diǎn))而促進(jìn)細(xì)胞增殖、參與胚胎發(fā)育及腫瘤的惡性進(jìn)展。Bmi-1基因決定著白血病干細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞等腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力，可作為基因治療腫瘤的靶點(diǎn)。

本研究選擇SYBR Green I熒光染料進(jìn)行定量反應(yīng)。這是一種雙鏈 DNA特異性結(jié)合的染料，在與雙鏈DNA結(jié)合之后，可以在特定的激發(fā)波長下發(fā)出熒光[6]。SY BR Green Ⅰ的最大優(yōu)點(diǎn)就是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單，成本低廉，通用性好，可用于對多種目的基因進(jìn)行檢測。

對于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，最為簡單、準(zhǔn)確的定量方法就是標(biāo)準(zhǔn)曲線法[7]，即用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同等條件下目的基因測得的熒光信號量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量。在標(biāo)準(zhǔn)曲線法中，靶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線通常是由標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行連續(xù)稀釋所得，以起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)、Ct 值為縱坐標(biāo)。由于質(zhì)粒大量制備方便、穩(wěn)定、濃度高、定量準(zhǔn)確，還可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)或不同實(shí)驗(yàn)室之間的定量分析，故一般采用質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。本研究應(yīng)用重組質(zhì)粒倍比稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r為 -1.00。本實(shí)驗(yàn)建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Bmi-1的方法具有較寬的定量范圍，在1.0×103～1.0×108copies/μL之間具有良好的線性關(guān)系。對于 SYBR GreenI實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物長度最好在300 bp以下。本方法的目的基因Bmi-1及內(nèi)參基因GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物分別為226 bp和221 bp，以保證PCR擴(kuò)增的高效率。

由于 SYBR Green I能夠非特異地結(jié)合于所有雙鏈DNA，所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，就會影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性[8]。在SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR中，為了進(jìn)一步確認(rèn)反應(yīng)的特異性，可對PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。當(dāng)只有特異性的PCR 產(chǎn)物形成時(shí)，在熔解曲線圖中只可見單一的峰。在本研究中， Bmi-1及GAPDH 的Tm 分別為80.4℃和84.4℃，熔解溫度均一，峰的形狀也較銳利。另外，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析也只有目的條帶，而沒有其他雜帶，表明本實(shí)驗(yàn)檢測Bmi-1特異性好。

Bmi-1基因與造血系統(tǒng)惡性腫瘤及實(shí)體瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，并為白血病干細(xì)胞自我更新所必需。Bmi-1基因在小鼠和人骨髓細(xì)胞中的表達(dá)水平與造血細(xì)胞的分化程度呈負(fù)相關(guān)，它在造血干細(xì)胞中高度表達(dá)，隨著造血干細(xì)胞向各系分化，Bmi-1基因表達(dá)水平下降。白血病是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，大量幼稚細(xì)胞無限制增殖，同時(shí)存在一定數(shù)量的白血病干細(xì)胞及祖細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，健康人外周血表達(dá)低水平的Bmi-1 mRNA，而急性白血病細(xì)胞中Bmi-1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，說明該基因可能參與了急性白血病的發(fā)生，是一種新的腫瘤標(biāo)志物。但Bmi-1基因能否作為急性白血病評價(jià)治療效果指標(biāo)仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究探索。

[1]Jacobs JJ,Kieboom K,Marino S,et al.The oncogene and Polycomb-group gene Bmi-1 regulates cell proliferation and senescence through the ink4a locus[J]. Nature,1999,397(6175): 164-168.

[2]Park IK，Qian D，Kiel M，et al.Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells[J]. Nature，2003,423(6937): 302-305.

[3]Liu S,Dontu G,Mantle ID,et al Hedgehog signaling and Bmi-1 regulate self-renewal of normal and malignant human mammary stem cells[J]. Cancer Res,2006,66(12):6063-6071.

[4]Kim JH,Yoon SY,Jeong SH,et al Overexpression of Bmi-1 oncoprotein correlates with axillary lymph node metastases in invasive ductal breast cancer[J].Breast,2004,13(5):383-388.

[5]Wong ML,Medrano JF. Real-time PCR for mRNA quantitation[J]. Biotechniques,2005,39(1):1-11.

[6]Simpson DA,Feeney S,Boyle C,et al.Retinal VEGF mRNA measured by SYBR green I fluorescence: a versatile approach to quantitative PCR[J]. Mol Vis，2000，6(10):178-183.

[7]Ke LD,Chen Z,Yung WK. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards[J].Mol Cell Probes,2000,14(2):127-135.

[8]Ririe KM,Rasmussen RP,Wittwer CT. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction[J]. Anal Biochem,1997,245(2):154-60.