王雪嬌，張開立，王宏宇，胡先福，李世杰，王 茜，李 宏，孫 媛

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系2007級(jí); 2.遼寧省癌癥基因組重點(diǎn)室及大連醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

胃癌(gastric cancer)是人體常見的惡性腫瘤[1]，其發(fā)病率有著明顯的地域性，在中國有包括大連在內(nèi)的多個(gè)胃癌高發(fā)區(qū)并且胃癌總發(fā)病人數(shù)約占世界總發(fā)病人數(shù)的41%[2]。因此，了解胃癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制，制訂出適合本地區(qū)胃癌預(yù)測(cè)、早期診斷和早期阻斷的有效措施極為迫切。

胃癌的病因復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的多階段復(fù)雜過程，涉及遺傳學(xué)(Genetics)與表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)的改變。DNA甲基化是最主要的表觀遺傳學(xué)修飾方式之一。大量證據(jù)表明，腫瘤的發(fā)生與抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化有關(guān)[3]。

在以往的工作中，作者對(duì)胃癌四個(gè)細(xì)胞系 MGC 803， BGC823，AGS， HGC-27的多基因多位點(diǎn)DNA甲基化特點(diǎn)(也稱CpG島甲基化表型，CpG Island Methylator Phenotype，CIMP)進(jìn)行比較鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MGC 803，BGC 823，AGS， HGC-27中的CIMP型依次為L， L， L和H。說明胃癌細(xì)胞系發(fā)生了不同程度的甲基化。但導(dǎo)致其不同程度甲基化的原因仍不清楚。

甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)可以在模板鏈的指導(dǎo)下，使半甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對(duì)應(yīng)的胞嘧啶甲基化[4]。近年的研究亦發(fā)現(xiàn)甲基化與UHRF1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，也稱為ICBP90)基因負(fù)責(zé)編碼一類指環(huán)型E3泛素酶的亞家族成員有關(guān)[5，6]。

而有關(guān)胃癌細(xì)胞系中的 CIMP 型，與 DNMT1及 UHRF1的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究擬對(duì)上述研究進(jìn)行分析，探討胃癌細(xì)胞表觀遺傳學(xué)改變的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

實(shí)驗(yàn)所需胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和HGC-27購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。MGC803(人胃低分化黏液癌)和BGC823(人胃低分化癌)從北京腫瘤研究所引進(jìn)。細(xì)胞用含10%胎牛血清,0.2%碳酸氫鈉和0.3% HEPES的DMEM培養(yǎng)液(Gibco,USA)加青霉素100 U/mL,鏈霉素100 U/mL在37℃ 5%二氧化碳和100%濕度的孵箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。用0.25%胰蛋白酶和0.04% EDTA的無鈣，鎂離子的PBS混合液消化處理細(xì)胞，重懸細(xì)胞于培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度，以2×105個(gè)/mL的密度分裝到含有培養(yǎng)液(pH7.2)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，混勻，將細(xì)胞懸液均勻鋪在培養(yǎng)皿中。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的RNA提取與分析按下述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。

1.2 RNA提取及RT-PCR

收集各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，分別置于1.5 mL的離心管中，用Trizol試劑提取總RNA進(jìn)行RT-PCR。

1.2.1 RNA提取：在每個(gè)裝有收集好細(xì)胞的Eppendorf管中加入200 μL TrizoL，搖勻，-20 ℃消化1 h；加入40 μL氯仿，輕輕震蕩15 s；室溫靜置3 min；離心(4℃，15 min×12000 g)；吸上清至新管同時(shí)加入100 μL異丙醇，搖勻，室溫靜置15 min；離心(4 ℃，10 min×12 000 g)，棄上清，用75%乙醇洗沉淀；離心(4 ℃，5 min×10 000 g)，棄去上清，晾干后用1‰ DEPC水20 μL溶解RNA；260 nm波長下測(cè)定總RNA濃度。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)：反轉(zhuǎn)錄體系20 μL，含模板RNA 0.5 μg；依照TaKaRa RNA LA PCRTMKit試劑盒提供說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)條件為：55 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min；PCR反應(yīng)體系15 μL，其中含：反轉(zhuǎn)錄液3 μL，MgCl20.9 μmol/L，10×LA PCR Buffer 1.2 μL，引物終濃度為0.225 μmol/L，TaqDNA聚合酶0.067 U，加水至15 μL。PCR反應(yīng)條件：UHRF1引物序列(TaKaRa生物工程有限公司)： 上游: 5’-GTC GGA TCA TCT TCG TGG ACG-3’；下游:5’-CTG TTC CGC GGT CCT CTT GTT-3’[7]。95 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s，32個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增片段長度為680 bp。DNMT1引物序列(TaKaRa生物工程有限公司)：上游： 5’- ACC GCT TCT ACT TCC TCG AGG CCT A -3’，下游：5’- GTT GCA GTC CTC TGT GAA CAC TGT GG -3’[8]；反應(yīng)條件94 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃ 35 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共循環(huán)35次，然后延伸72 ℃ 5 min; 擴(kuò)增片段長度為335 bp，內(nèi)參為β-actin。

擴(kuò)增產(chǎn)物直接加入3 μL 6×溴酚藍(lán)載樣緩沖液混勻，2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像，并進(jìn)行密度分析，觀察各組目的基因的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用mean±SD標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，對(duì)各組均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.01為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

RT-PCR結(jié)果顯示，CIMP型不同的4個(gè)胃癌細(xì)胞系中DNMT1，UHRF1表達(dá)有所差異。DNMT1在CIMP-L型的MGC803和AGS中的表達(dá)水平較低，但在CIMP-L型BGC823和CIMP-H型HGC-27中明顯增加。與MGC803和AGS比較差異有顯著性意義(P<0.01)，DNMT1表達(dá)水平與CIMP型鑒定結(jié)果并不一致(圖1、表1)。而UHRF1在HGC-27中有高水平表達(dá),與其他3個(gè)胃癌細(xì)胞系比較差異有顯著性意義(P<0.01),其表達(dá)水平與CIMP型基本一致(圖1、表1)。

圖1 4個(gè)胃癌細(xì)胞系中DNMT1與UHRF1表達(dá)特點(diǎn)及CIMP型鑒定結(jié)果

表1 4個(gè)胃癌細(xì)胞系中DNMT1及UHRF1的RT-PCR結(jié)果(與β-actin IOD的比值)

DNMT1UHRF1MGC8030.5271±0.02340.5151±0.0157BGC8230.9518±0.02551)2)0.5130±0.0223AGS0.5403±0.03900.5026±0.0240HGC-270.9179±0.04491)2)0.8066±0.01041)2)3)

1)與MGC803相比，P<0.01; 2)與AGS相比，P<0.01;3)與BGC823相比，P<0.01

3 討 論

胃癌是世界最常見惡性腫瘤之一。癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后和療效的主要因素。侵襲性和轉(zhuǎn)移性是腫瘤細(xì)胞最為重要的生物學(xué)行為，涉及黏附、降解、運(yùn)動(dòng)和增殖過程，并經(jīng)由淋巴道、血道或腔道轉(zhuǎn)移至靶器官和組織。這個(gè)復(fù)雜過程的完成，需要多種因子參與和相互作用，涉及遺傳學(xué)與表觀遺傳學(xué)改變。其中DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的主要方式，其所致異?；虺聊c多數(shù)腫瘤發(fā)生有關(guān)。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的最主要方式。它是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下，以S腺苷蛋氨酸(SAM)為供體，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位C原子上而形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化具有序列特異性，主要發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上。通常情況下，基因組中的多數(shù)基因(包括全部管家基因和部分組織特異性基因)的5’啟動(dòng)子區(qū)域富含CpG序列，稱為CpG島。其甲基化狀態(tài)直接影響基因的表達(dá)，這也是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式之一。

一般而言，DNA甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá)。發(fā)生在基因啟動(dòng)子或其附近區(qū)域的甲基化將直接阻礙AP-2、c-Myc、E2F和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，使基因不能轉(zhuǎn)錄或降低基因的轉(zhuǎn)錄水平。 同時(shí)，基因5’端的調(diào)控元件發(fā)生甲基化后能結(jié)合特定甲基化CpG序列結(jié)合蛋白(methyl CpG binding protein, MBP)，從而間接阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。此外，甲基化還可以通過改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象使染色質(zhì)凝縮成非活性的高級(jí)結(jié)構(gòu)[9]。因此，DNA甲基化可以導(dǎo)致基因沉默(gene silence)，去甲基化(demethylation)可以作為一個(gè)沉默基因重新激活(reactivation)的開關(guān)[10]。

在表觀遺傳學(xué)(epigenetics)研究中，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著極為重要的密切關(guān)系，特別是抑癌基因的CpG島甲基化問題在近年來愈來愈受到重視[11]。研究認(rèn)為，異常甲基化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。DNA甲基化狀態(tài)的改變直接影響了抑癌基因表達(dá)、基因組的穩(wěn)定性，并且與基因突變有關(guān)。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)催化DNA甲基化的發(fā)生與維持，在有DNA異常甲基化機(jī)制參與發(fā)生的腫瘤細(xì)胞中常為過度表達(dá)。在以往的工作中，我們對(duì)胃癌四個(gè)細(xì)胞系 MGC803， BGC823，AGS， HGC-27的多基因多位點(diǎn)DNA甲基化特點(diǎn)(也稱CpG島甲基化表型，CpG Island Methylator Phenotype，CIMP)進(jìn)行比較分析，共選擇p16，hMLH1，TIMP-3，MINT2和RASSFIA共5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行甲基化檢測(cè)并將之分為三級(jí)：如果發(fā)現(xiàn)其中3～5個(gè)loci發(fā)生甲基化，則定義為CIMP-H；發(fā)現(xiàn)1～2個(gè)loci發(fā)生甲基化，則定義為CIMP-L；如果這5個(gè)位點(diǎn)沒有一個(gè)發(fā)生甲基化則定義為CIMP-N。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MGC803，BGC823，AGS， HGC-22中的CIMP型依次為L，L，L和H。說明胃癌細(xì)胞系發(fā)生了不同程度的甲基化。本研究對(duì)胃癌細(xì)胞系中DNMT1的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在4種細(xì)胞系中，DNMT在BGC823和HGC-27中都高表達(dá)(P<0.01)，與CIMP型鑒定結(jié)果并不一致，即在DNMTs基因高表達(dá)的BGC823細(xì)胞系中，作者并沒有檢測(cè)到有多位點(diǎn)異常高甲基化的特征。這是否意味著存在其他甲基化調(diào)控機(jī)制的可能性？這種潛在的調(diào)控因素通過與DNMTs共同作用影響來保證甲基化狀態(tài)在DNA復(fù)制過程中的維持。因此，本研究進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

UHRF1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，也稱為ICBP90)基因負(fù)責(zé)編碼一類指環(huán)型E3泛素酶的亞家族成員。一般認(rèn)為UHRF1可以通過編碼蛋白與特定的DNA序列結(jié)合，進(jìn)一步召集組蛋白去乙?；赣绊懭旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)而發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用。近年來有學(xué)者指出，UHRF1蛋白具有一個(gè)甲基化DNA的結(jié)合區(qū)域——稱作SRA(SET and RING associated)域[5]。在DNA復(fù)制過程中，UHRF1蛋白對(duì)DNA甲基化狀態(tài)的維持發(fā)揮關(guān)鍵性作用——它可以識(shí)別半甲基化的DNA子鏈，并召集DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1聚合在DNA鏈上，將半甲基化DNA雙鏈轉(zhuǎn)變成完全甲基化DNA。從而使得DNA甲基化狀態(tài)在復(fù)制和傳代過程中得到維持。

作者發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系中UHRF1表達(dá)特點(diǎn)為只在HGC-27中高表達(dá)，而在MGC803、BGC823及AGS中表達(dá)程度較低(P<0.01)，與CIMP型鑒定結(jié)果基本一致，提示UHRF1的表達(dá)是DNMT1進(jìn)行甲基化的重要環(huán)節(jié)，UHRF1和DNMT1的同時(shí)高表達(dá)可能是胃癌甲基化程度高的主要原因。

本研究成果不僅從理論上可以對(duì)DNA甲基化發(fā)生和維持的分子機(jī)制加以補(bǔ)充和完善，而且提供了一個(gè)非常重要的表觀調(diào)控關(guān)鍵分子UHRF1，對(duì)臨床腫瘤表觀遺傳干預(yù)具有非常重要的指導(dǎo)意義——為高發(fā)區(qū)胃癌的病因?qū)W分析以及臨床疾病預(yù)測(cè)、預(yù)防和治療提供重要的生物學(xué)指標(biāo)。

[1] Vauhkonen M, Vauhkonen H, Sipponen P. Pathology and molecular biology of gastric cancer[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol， 2006, 20(4): 651-674.

[2] http://www-depdb.iarc.fr/globocan2002.htm.

[3] Kurkjian C, Kummar S, Murgo AJ. DNA methylation: its role in cancer development and therapy[J]. Curr Probl Cancer，2008, 32(5):187-235.

[4] Jeltsch A. Molecular enzymology of mammalian DNA methyltransferases[J].Curr Top Microbiol Immunol，2006，301(1):203-225.

[5] Avvakumov GV, Walker JR, Xue S, et al. Structural basis for recognition of hemi-methylated DNA by the SRA domain of human UHRF1[J]. Nature，2008，455(7214):822-825.

[6] Jeong S, Liang G, Sharma S, et al. Selective anchoring of DNA methyltransferases 3A and 3B to nucleosomes containing methylated DNA[J]. Mol Cell Biol，2009，29(19):5366-5376.

[7] GAO X, SUN Y, HUANG L, et al. Down-regulation of Caveolin-1 in Gastric Carcinoma and Its Clinical Bilogical Significance[J]. Chin J Cancer，2005,24(3):311-316.

[8] Abbady AQ, Bronner C, Bathami K, et al. TCR pathway involves ICBP90 gene down-regulation via E2F binding sites[J]. Biochem Pharmacol，2005，70(4)：570-579.

[9] Fang JY, Mikovits JA, Bagni Rl. Infection of lymphoid cells by integration-defective human immunodeficiency virus type 1 increases de novo methylation[J]. J Virol，2001，75(20):9753-9761.

[10] Yu N, Wang M.Anticancer drug discovery targeting DNA hypermethylation[J]. Curr Med Chem，2008，15(14):1350-1375.

[11] Kai-Li Zhang, Yuan Sun, Yan Li ,et al. Increased frequency of CpG island methylator phenotype and CDH1 methylation in a gastric cancer high-risk region of China[J]. Translational Oncol，2008，1(1):28-35.