宋 陽(yáng)，王莉芬，石 林，杜翠萍

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 耳鼻喉科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116027)

鼻咽癌是中國(guó)高發(fā)惡性腫瘤之一，占頭頸部惡性腫瘤發(fā)病率的首位。其發(fā)生與遺傳因素、EBV及環(huán)境因素等有關(guān)[1]。機(jī)體免疫低下被認(rèn)為是鼻咽癌發(fā)生的重要因素[2，3]。早期人們就開(kāi)始關(guān)注鼻咽癌組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，且有作者報(bào)道鼻咽癌組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量與預(yù)后有關(guān)[4]。也有人提出鼻咽癌組織中T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5，6]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道多采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)鼻咽癌患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群的分布情況[7，8]，但有關(guān)鼻咽癌組織中淋巴細(xì)胞亞群分布的研究較少，而局部免疫應(yīng)答更利于控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本文采用免疫組化技術(shù)對(duì)比鼻咽癌組織與慢性鼻咽部炎組織中CD3+、CD4+、CD8+、 CD20+淋巴細(xì)胞情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

45例鼻咽癌標(biāo)本均來(lái)自大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2002 年1 月～2007年9 月存檔蠟塊。男性37 例,女性8 例。年齡41～88歲,平均年齡64.5歲。其中，28例為未分化型非角化性癌;17例為分化型非角化性癌。33例伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，12例不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；另取同期33例慢性鼻咽炎患者作為對(duì)照組，男性16 例,女性17 例。年齡33～74歲,平均年齡53.5歲。蠟塊均經(jīng)再次切片，HE染色，光鏡觀察再次明確病理診斷。

1.2 方 法

1.2.1 試 劑：鼠抗人CD4單克隆抗體(Clone,ZM-0418)；兔抗人CD8單克隆抗體(Clone,ZA-0508)；兔抗人CD3多克隆抗體(Clone,RMA-0543)；鼠抗人CD20單克隆抗體(Clone，MAB-002)以上均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

KIT-5020快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物；SPKIT-AI動(dòng)物非免疫血清(羊)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑；DAB 顯色試劑，(DAB -0031/1031)，以上均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法：免疫組化方法：標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)免疫組織化學(xué)染色。

1.3 結(jié)果判斷

參照許良中免疫組化反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。

CD3+、CD4+、CD8+、CD20+均以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜染色呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)；先用低倍鏡掃視整個(gè)切片,尋找淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的高密度區(qū)域后,在高倍視野(40×10)下記錄5個(gè)視野,計(jì)數(shù)被染成棕色的淋巴細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量占所有淋巴細(xì)胞的10%以?xún)?nèi)為(-),11%～ 25%為(+),26%～ 50%為(++),> 50%為(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果

33例慢性鼻咽炎組織中上皮下淋巴組織均呈不同程度增生，26例形成濾泡，7例淋巴細(xì)胞彌漫性增生，并見(jiàn)數(shù)量不等的漿細(xì)胞浸潤(rùn)及毛細(xì)血管增生。45例鼻咽癌均見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，癌組織間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)淋巴濾泡，少數(shù)標(biāo)本癌旁組織(呈慢性炎癥改變)中可見(jiàn)淋巴濾泡。

2.2 免疫組化結(jié)果與分析

2.2.1 CD3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)：鼻咽癌組織中CD3+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率(53.33%)與鼻咽炎組(81.82%)比較差異有顯著性意義；χ2=8.96，P<0.05(表1、圖2)。

2.2.2 CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)：鼻咽癌組織中CD4+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率(20%)與鼻咽炎組(42.24%)比較差異有顯著性意義，χ2=4.60，P<0.05。(表2，圖3、4)。

2.2.3 CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)：鼻咽癌組織中CD8+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率(77.77%)與鼻咽炎組(78.79%)比較差異無(wú)顯著性意義，χ2=3.51，P>0.05。(表3，圖5、6)。

2.2.4 CD20+B淋巴細(xì)胞表達(dá)

鼻咽癌組織中CD20+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率(48.89%)與鼻咽炎組(63.64%)比較差異無(wú)顯著性意義，χ2=1.89，P>0.05(表4，圖7、8)。

表1 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD3+T淋巴細(xì)胞 %(例數(shù))

表2 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD4+ T淋巴細(xì)胞 %(例數(shù))

圖1慢性鼻咽炎中CD3+T淋巴細(xì)胞(×200)

圖2鼻咽癌組織中CD3+T淋巴細(xì)胞(×200)

圖3慢性鼻咽炎中CD4+T淋巴細(xì)胞(×200)

圖4鼻咽癌組織中CD4+T淋巴細(xì)胞(×200)

圖5鼻咽癌組織CD8+T淋巴細(xì)胞(×200)

圖6慢性鼻咽炎CD8+T淋巴細(xì)胞(×200)

圖7鼻咽癌組織中CD20+B淋巴細(xì)胞(×200)

圖8慢性鼻咽炎中CD20+B淋巴細(xì)胞(×200)

表3 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD8+ T淋巴細(xì)胞 %(例數(shù))

表4 鼻咽癌和慢性鼻咽炎CD20+ B淋巴細(xì)胞 %(例數(shù))

2.2.5 鼻咽癌組織中CD4+/CD8+比值(0.26)比慢性鼻咽炎組(0.54)減少，明顯小于正常值(CD4+/CD8+比值正常為1.76±0.58)

3 討 論

本文觀察了33例慢性鼻咽炎及45例鼻咽癌患者的淋巴細(xì)胞亞群的分布情況。其中，33例慢性鼻咽炎組織，26例形成濾泡，CD20+B淋巴細(xì)胞密集分布于淋巴濾泡中，CD3+T淋巴細(xì)胞主要分布于濾泡周?chē)f(shuō)明在慢性鼻咽炎中B淋巴細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，提示慢性鼻咽炎局部免疫以體液免疫為主。而在45例鼻咽癌組織中，各種淋巴細(xì)胞亞群分布均少于間質(zhì)；同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中CD4+T淋巴細(xì)胞、CD3+T淋巴細(xì)胞較慢性鼻咽炎組減少，而兩組間CD8+T淋巴細(xì)胞、CD20+B淋巴細(xì)胞差異不明顯，且鼻咽癌組織中CD4+/CD8+比值(0.26)較慢性鼻咽炎組(0.54)減小，明顯小于正常值，提示鼻咽癌患者鼻咽部組織確實(shí)存在免疫功能紊亂，這主要是細(xì)胞免疫功能障礙所致。

近年來(lái)研究表明，腫瘤免疫分為細(xì)胞免疫和體液免疫，其中細(xì)胞免疫與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。在細(xì)胞免疫中T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[10]，在腫瘤免疫監(jiān)視及效應(yīng)中起著重要作用。T淋巴細(xì)胞主要有兩類(lèi)，CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞。CD4+和CD8+的總稱(chēng)為T(mén)3(CD3+)。CD4+T淋巴細(xì)胞可以從多方面增強(qiáng)細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)多種效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的活性。 CD8+T淋巴細(xì)胞可抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，可對(duì)靶細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用,抑制免疫反應(yīng)。研究表明，Th與Ts之間相互誘導(dǎo)和制約所形成的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)對(duì)于調(diào)控免疫反應(yīng)及維持免疫自穩(wěn)具有重要作用[11]。如果某些原因引起Th細(xì)胞減少和(或)Ts細(xì)胞增多,都會(huì)影響機(jī)體抗腫瘤的免疫功能。機(jī)體免疫功能正常時(shí)，可及時(shí)清除體內(nèi)EBV以及發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 ；機(jī)體免疫功能下降時(shí)，尤其T淋巴細(xì)胞功能出現(xiàn)缺陷和協(xié)調(diào)紊亂時(shí)，EBV能逃逸免疫細(xì)胞的殺傷而持續(xù)感染，而且發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞也能逃逸免疫細(xì)胞的殺傷而存活下來(lái)，最終致癌 。CD4+、CD8+細(xì)胞必須同時(shí)作用，T細(xì)胞抗腫瘤才能發(fā)揮良好的效果。因此，通過(guò)監(jiān)測(cè)鼻咽癌組織中CD4+、CD8+及CD3+細(xì)胞數(shù)的變化對(duì)疾病診斷、藥物治療、預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義[12]。

隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，腫瘤的綜合治療必將成為主流。生物治療將成為腫瘤治療的常規(guī)療法，它與目前手術(shù)、放療、化療三大常規(guī)療法有明顯的協(xié)同，其抗腫瘤的特異性和免疫記憶是其他方法所不能比擬的，在防止腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移方面免疫治療的地位更為重要。目前，在鼻咽癌方面出現(xiàn)了EBV特異性過(guò)繼免疫治療[13]，并已成為腫瘤內(nèi)科治療的研究熱點(diǎn)。過(guò)繼免疫治療是指向腫瘤患者轉(zhuǎn)輸具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體抗腫瘤的免疫效應(yīng)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。具有高親和性的單克隆的T淋巴細(xì)胞或特異免疫功能是提高腫瘤免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[14,15]。本實(shí)驗(yàn)中，局部CD3+、 CD4+均表達(dá)降低，提示能在局部開(kāi)展特異性的過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療，向其轉(zhuǎn)輸具有抗腫瘤活性的具有特異性殺傷效應(yīng)的CD4+細(xì)胞，直接殺傷腫瘤從而達(dá)到治療腫瘤的目的。但具體實(shí)施過(guò)程有待于今后在實(shí)驗(yàn)中更深層次的研究。

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