曹麗華，康 健，王 洋 ，孫 麗 ，陳 瑜

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 呼吸疾病研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110001；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 呼吸科，遼寧 大連 116027；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 呼吸科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性進(jìn)展惡化的炎癥性疾病[1]。細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞因子導(dǎo)致的氣道炎癥為COPD發(fā)病的重要機(jī)制之一。吸煙可刺激單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥因子、趨化因子及細(xì)胞因子，如TNF-α、細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)-1、 IL-6、 IL-8等，導(dǎo)致白細(xì)胞黏附、移行到炎癥部位參與炎癥反應(yīng)[2]。但是過(guò)度的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶，氧化劑及金屬蛋白酶等引起組織破壞及增加黏蛋白分泌促進(jìn)COPD的發(fā)生和發(fā)展[3]?？寡字委熆梢匝泳廋OPD進(jìn)展、改善預(yù)后。

標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油是一種從植物中提取的脂溶性揮發(fā)油，其主要成分是桉油素、檸檬烯和α-蒎烯,它能夠改善黏液纖毛清除功能[4]，體外實(shí)驗(yàn)證明它還有一定的抗炎作用。本研究利用被動(dòng)吸煙的方法建立的COPD大鼠模型來(lái)觀察標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油對(duì)氣道炎癥的影響。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar雄性大鼠，體重(200±20)g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油(商品名：吉諾通)為德國(guó)保時(shí)佳大藥廠(chǎng)產(chǎn)品。

1.1.3 儀器及試劑：自制吸煙染毒箱；顯微鏡；小動(dòng)物肺功能儀；離心機(jī)；SABC免疫組化試劑盒；兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體；ELISA試劑盒等。

1.2 方 法

1.2.1 COPD模型制備：雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、COPD模型組、標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組，每組8只。將大鼠置于自制染毒箱內(nèi)先后點(diǎn)燃14支大前門(mén)牌香煙，煙霧暴露0.5 h，2次/d，間隔4 h，每周暴露6 d，持續(xù)暴露12周。對(duì)照組不做任何干預(yù)。標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組于煙霧暴露前30 min給予標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油300 mg/kg灌胃治療至第12周末。

1.2.2 動(dòng)物病理標(biāo)本制備及病理形態(tài)學(xué)檢查：將肺臟連同氣管一起從胸腔取出，向右主支氣管內(nèi)灌注4%多聚甲醛溶液，直至右肺膨脹邊緣變銳，結(jié)扎右主支氣管，固定0.5 h，取中葉肺置入4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)制片,HE染色進(jìn)行病理學(xué)檢查。應(yīng)用病理圖文分析系統(tǒng)，10倍物鏡下，HE切片沿最大橫徑和縱徑隨機(jī)選擇5個(gè)視野測(cè)定平均內(nèi)襯間隔(MLI)與平均肺泡數(shù)(MAN)，評(píng)估肺氣腫程度。

1.2.3 大鼠呼吸功能測(cè)定：COPD模型組、對(duì)照組各隨機(jī)取6只大鼠，經(jīng)1% 戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分離暴露氣管，行氣管插管并固定，將大鼠仰臥位置于密閉體描箱內(nèi)，采用小動(dòng)物呼吸功能測(cè)定儀測(cè)定大鼠第0.3秒用力呼氣量(FEV0.3)，第0.3秒用力呼氣量(FEV0.3)與用力肺活量(FVC)的比值，即(FEV0.3/FVC)%。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗:麻醉大鼠，于氣管壁上剪一T字形切口，以2 mL生理鹽水灌洗左肺，反復(fù)3次，總回收量約為5 mL。將BALF 1200 r/min離心，取沉渣涂片，瑞士-吉姆薩染色，光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)氣道ICAM-1的表達(dá)：采用SABC法在石蠟切片上測(cè)ICAM-1的免疫組化表達(dá)，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。每張切片隨機(jī)取含支氣管的視野5個(gè)，于200倍光鏡下進(jìn)行采圖；使用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件Metamorph測(cè)量支氣管肺組織陽(yáng)性呈色區(qū)域的平均積分光密度值，取5個(gè)視野的平均值作為所測(cè)指標(biāo)的蛋白表達(dá)量。

1.2.6 肺組織勻漿TNF-α、IL-6的含量測(cè)定：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 吸煙導(dǎo)致COPD大鼠模型

大鼠肺組織的病理變化：對(duì)照組氣管黏膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞完整，纖毛排列整齊，氣管及各級(jí)支氣管只有少量杯狀細(xì)胞。COPD模型組氣管黏膜上皮部分脫落，杯狀細(xì)胞及腺體增生肥大，管壁有以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡壁變薄、斷裂，肺泡腔擴(kuò)大融合，肺氣腫形成。標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組的病理改變基本與COPD模型組相同(圖1)。COPD模型組和標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組MLI明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；MAN明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)。COPD模型組和標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組FEV0.3/FVC明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1肺功能及肺臟形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果的比較

組別FEV0.3/FVC(%)肺平均內(nèi)襯間隔(個(gè))平均肺泡數(shù)(個(gè))對(duì)照組84.68±6.30193.00±13.7131.50±3.78模型組71.65±3.601)290.42±12.471)19.60±4.271)標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組75.25±4.231)299.50±57.601)19.38±7.441)

1)與對(duì)照組相比P<0.05

圖1 各組大鼠肺部病理改變(×100)A：正常對(duì)照組； B：COPD組； C：標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組

2.2 各組BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)

與正常對(duì)照組相比，COPD模型組及標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組BALF細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)均明顯增高(P<0．05)。與COPD模型組相比,標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組BALF細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)減少，差異有顯著性意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)

2.3 ICAM-1免疫組化染色

ICAM-1免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。COPD模型組支氣管上皮細(xì)胞及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-I表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組呈陽(yáng)性，對(duì)照組呈弱陽(yáng)性(圖3A、B、C)。標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油可顯著降低支氣管上皮及毛細(xì)血管內(nèi)皮ICAM-1表達(dá)的水平(P<0.05)，見(jiàn)圖3D。

2.4 ELISA法測(cè)定肺組織內(nèi)TNF-α、IL-6表達(dá)

EL1SA檢測(cè)結(jié)果顯示 COPD組及標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組大鼠支氣管肺組織內(nèi)TNF-α、IL-6表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增高(P<0.05)；標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組TNF-α、IL-6含量較COPD組明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5 COPD大鼠BALF中性粒細(xì)胞數(shù)與肺組織TNF、IL-6、ICAM-1表達(dá)的關(guān)系

圖3 各組大鼠支氣管上皮ICAM-1表達(dá)A、B、C：免疫組化×400； A：正常對(duì)照組； B：COPD組； C：標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組； D：3組ICM-1積分光密度比較

圖4 各組大鼠肺內(nèi)TNF-α、IL-6的表達(dá)

相關(guān)分析顯示模型組BALF中性粒細(xì)胞數(shù)與支氣管上皮ICAM-1表達(dá)強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)(r=0.571，P均<0.05)，也與肺組織中TNF、IL-6含量呈顯著正相關(guān)(r=0.623、0.691，P均<0.05)。

3 討 論

吸煙被認(rèn)為是COPD發(fā)生發(fā)展的最重要危險(xiǎn)因素。本研究采用被動(dòng)吸煙的方法建立COPD的大鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸煙12周大鼠支氣管肺組織病理形態(tài)學(xué)基本符合人類(lèi)肺氣腫的病理特點(diǎn)；同時(shí)，

FEV0.3/FVC明顯降低，符合氣流受限為特征的肺通氣功能障礙，造模成功[5]。

大量數(shù)據(jù)顯示吸煙損傷呼吸道免疫防御系統(tǒng)，感染病原體不能被有效清除，增加氣道免疫炎癥反應(yīng)，促進(jìn)COPD的發(fā)生和發(fā)展[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明COPD組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組、肺組織勻漿中前炎癥因子TNF、IL-6明顯增高、支氣管上皮細(xì)胞及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-I表達(dá)增多。BALF中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與

肺組織前炎癥因子及ICAM-I表達(dá)呈正相關(guān)。上述結(jié)果提示COPD組炎癥反應(yīng)明顯增加，氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞的聚集與TNF-α、IL-6、ICAM-1的趨化和黏附作用密不可分。

近年來(lái)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)桉油素具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，能減少前炎癥因子如TNF-α、IL-1β的釋放[7]。目前關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油在體內(nèi)的抗炎作用少有研究。本研究復(fù)制了大鼠COPD模型,觀察標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油在氣道炎癥中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與COPD組相比，標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油對(duì)大鼠肺組織中勻漿中TNF及IL-6有明顯的抑制作用；免疫組化研究發(fā)現(xiàn),標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油組ICAM-1陽(yáng)性染色區(qū)域和程度明顯減輕,通過(guò)圖像分析系統(tǒng)測(cè)得的積分光密度值明顯低于COPD組,說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油能抑制吸煙引起ICAM-1的表達(dá)?？傊?，標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油能抑制氣道炎癥。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油抑制炎癥反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)桃金娘油能改善由吸煙導(dǎo)致的氣道炎癥，有望延緩COPD進(jìn)展，為COPD的治療提供了一個(gè)新的視角。

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