李 健，謝振鈞，孟 鑫，陳廣濱，陳 鵬，王惠亭

(大連大學(xué) 附屬新華醫(yī)院 骨科，遼寧 大連 116021)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是50歲以上人群肢體功能殘疾造成經(jīng)濟(jì)損失和影響社會(huì)發(fā)展的主要疾病之一，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、變形和活動(dòng)受限，且伴有不同程度的滑膜炎癥。炎癥又可導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎病情的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)采用生長(zhǎng)抑素關(guān)節(jié)內(nèi)注射，通過光鏡、電鏡觀察以及關(guān)節(jié)液中超氧化物歧化酶(SOD)的測(cè)定，探討用生長(zhǎng)抑素關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療骨性關(guān)節(jié)炎的可行性，以期為防治該病提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康的新西蘭雄性白兔30只，體重2.5～3.0 kg，由大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，室溫15～25℃，濕度45%～55%，每日正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品、器材及試劑

生長(zhǎng)抑素 3 mg/支(南京長(zhǎng)澳制藥)。X光機(jī)(日本 島津) 721分光光度計(jì)(上海 生化)臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(上海 生化)掃描電鏡、光鏡(日本奧林巴司)SOD試劑盒(沈陽(yáng) 眾和)。

1.3 造模與分組

白兔30只建立骨關(guān)節(jié)炎模型，模型動(dòng)物左側(cè)膝關(guān)節(jié)為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)為對(duì)照組。根據(jù)Hulth造模方法，用5%硫噴妥鈉從兔耳緣靜脈麻醉后，將兔仰臥捆綁于手術(shù)臺(tái)上，取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱行切口，長(zhǎng)約4 cm，探查關(guān)節(jié)腔無原發(fā)病變，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板，逐層縫合傷口，無菌敷料及繃帶包扎固定。術(shù)后抗炎治療3 d，分籠飼養(yǎng)，造模后每天訓(xùn)練模型活動(dòng)1 h，距離400 m左右[1]。

1.4 給藥劑量與方法

2周后向?qū)嶒?yàn)側(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.5 mL生長(zhǎng)抑素溶液(含生長(zhǎng)抑素250 μg)，向?qū)φ諅?cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入鹽水0.5 mL。1次/周，連續(xù)4周。造模后籠中飼養(yǎng)，任其自由活動(dòng)。于造模后12周抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)液后將其處死，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定關(guān)節(jié)液中SOD的含量，取關(guān)節(jié)軟骨及滑膜進(jìn)行組織學(xué)觀察[2]。

1.5 觀察指標(biāo)

①X線觀察：處死動(dòng)物前拍攝兔膝關(guān)節(jié)正側(cè)位CR片，觀察膝關(guān)節(jié)X線表現(xiàn)。②關(guān)節(jié)軟骨大體觀察：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后，對(duì)照組取股骨內(nèi)髁，實(shí)驗(yàn)組取股骨內(nèi)髁，肉眼大體觀察軟骨面情況。③關(guān)節(jié)軟骨組織光鏡觀察：取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨及滑膜，修整成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織塊，切片、HE染色，光鏡下按照Mankins評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的層次、軟骨細(xì)胞以及軟骨下骨的變化進(jìn)行觀察[3]。 ④關(guān)節(jié)軟骨組織掃描電鏡觀察：取其股骨內(nèi)髁軟骨，以3%戊二醛前固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS)清洗3次，乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換，CO2臨界點(diǎn)干燥，粘托、噴金，掃描電鏡觀察，拍照[4]。⑤測(cè)定關(guān)節(jié)液中SOD含量：取關(guān)節(jié)滑膜勻漿液，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)各管吸光度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組間比較采用兩樣本均數(shù)雙側(cè)t檢驗(yàn)判斷,組內(nèi)比較用方差分析;P<0.05為差異有顯著性意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 兔膝關(guān)節(jié)正側(cè)位CR 片觀察

實(shí)驗(yàn)組見膝關(guān)節(jié)外側(cè)間隙輕微變窄,關(guān)節(jié)面輕微硬化,未見明顯骨贅形成 。對(duì)照組可見膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙明顯變大,外側(cè)間隙變窄,呈外翻畸形,關(guān)節(jié)面硬化,骨端失去正常的對(duì)合關(guān)系嚴(yán)重者呈半脫位狀態(tài),股骨內(nèi)髁、脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)緣有明顯骨贅形成，見圖1。

圖1 12周模型X線片

2.2 軟骨大體觀察

實(shí)驗(yàn)組打開關(guān)節(jié)后見關(guān)節(jié)液量明顯少于對(duì)照組,軟骨色澤變淡,光澤度降低,軟骨見軟化灶,滑膜可見少量增生。對(duì)照組可見關(guān)節(jié)軟骨外觀明顯失去原有光澤,發(fā)黃,色澤變暗淡,尤以股骨內(nèi)髁為著。大多數(shù)軟骨面上可見2～3 個(gè)長(zhǎng)徑約3～5 mm的 卵圓形軟化灶,滑膜則存在不同程度增生粘連,關(guān)節(jié)液量增多,未見明顯骨贅形成[5]。

2.3 光鏡觀察

2.3.1 關(guān)節(jié)軟骨光鏡下表現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組軟骨表面光滑,四層結(jié)構(gòu)清晰可辨，軟骨細(xì)胞排列整齊，潮線完整,染色質(zhì)均勻分布(圖2)。對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨表層變薄、粗糙,部分區(qū)域成絨毛狀,可見較多裂隙從表層軟骨延伸向下深達(dá)放射層,裂隙中可見稀疏結(jié)締組織及松散的網(wǎng)狀連接,部分軟骨細(xì)胞核固縮壞死,偏于一側(cè),鈣化層軟骨細(xì)胞呈簇狀,軟骨細(xì)胞排列紊亂,4 層結(jié)構(gòu)不易分辨,潮線多不完整或完全消失(圖3)。與對(duì)照組比較，第12周實(shí)驗(yàn)組Mankins評(píng)分結(jié)果明顯降低。見表1。

表1 第12周實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Mankins評(píng)分

1)與對(duì)照組相比，P<0.05

2.3.2 滑膜光鏡下表現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組滑膜上皮無增生,間質(zhì)水腫,有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組可見滑膜下毛細(xì)血管增生,間質(zhì)水腫,可見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

2．4 電鏡觀察

透射電鏡觀察：實(shí)驗(yàn)組可見軟骨細(xì)胞形態(tài)基本正常,細(xì)胞器欠豐富,核染色尚可,膠原纖維稍紊亂(圖4)。對(duì)照組軟骨細(xì)胞明顯固縮、壞死,外形不規(guī)則,細(xì)胞周暈消失,核膜不明顯,表面微絨毛突起減少,胞漿內(nèi)細(xì)胞器凝成高電子密度的片狀物不易分辨,可見數(shù)個(gè)脂滴存在,基質(zhì)中膠原纖維部分?jǐn)嗔?纖維直徑增粗(圖5)。

2.5 SOD關(guān)節(jié)液檢測(cè)

與同期對(duì)照組相比，12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)滑液中SOD的含量明顯增高(P<0.05)，見表2。

表2 第12周實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)液SOD活力測(cè)定結(jié)果比較

1)與對(duì)照組同期相比,P<0.05

3 討 論

膝骨性關(guān)節(jié)炎可以分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。二者引起關(guān)節(jié)損傷的病理是相同的,即軟骨受損,軟骨下骨板由于缺乏軟骨的保護(hù),受到異常壓力而發(fā)生代償性增生(骨贅形成),滑膜發(fā)生炎癥反應(yīng)。骨性關(guān)節(jié)炎的確切病因目前尚未完全明了,但研究表明,自由基、一氧化氮、細(xì)胞凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子、自身免疫反應(yīng)、骨內(nèi)壓升高等因素與本病的發(fā)病有關(guān)[6]。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察OA 模型動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨的病理變化來探討生長(zhǎng)抑素的治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組在病理程度上的改變明顯較對(duì)照組輕,軟骨表面裂紋少,膠原纖維結(jié)構(gòu)基本完整,固縮的軟骨細(xì)胞較少,雖可見部分退變的軟骨細(xì)胞,但部分軟骨細(xì)胞具有較多的細(xì)胞器,某些區(qū)域形成軟骨細(xì)胞簇,表明軟骨細(xì)胞通過增強(qiáng)合成和分泌功能來修復(fù)軟骨。

氧自由基是指在參與各種生物代謝過程中未被完全還原而產(chǎn)生的一系列不穩(wěn)定的原子、離子、原子團(tuán)和分子,他們外層電子軌道有不配對(duì)電子,性質(zhì)極其活躍。OA 患者體內(nèi)有較多的退變壞死的碎屑,為處理這些碎屑,大量多形核白細(xì)胞( PMN) 進(jìn)入關(guān)節(jié),由于特殊代謝刺激物的刺激,使其代謝被激活產(chǎn)生大量的氧自由基,一方面破壞正常軟骨細(xì)胞,另一方面又侵害PMN 本身,造成軟骨進(jìn)一步損害。氧自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)使基質(zhì)中膠原纖維發(fā)生交聯(lián),形成大分子物質(zhì),而使膠原蛋白僵硬失去彈性[7]。因此，研究自由基清除劑、提高SOD 活性、保護(hù)軟骨細(xì)胞免受自由基損傷是治療和預(yù)防OA 的重要課題。邵敏[8]采用兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)觀察中藥補(bǔ)腎活血方對(duì)SOD 的影響,從細(xì)胞分子水平研究中藥補(bǔ)腎活血方防治OA 的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥補(bǔ)腎活血方對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用的可能途徑有明顯提高SOD 活性,阻止自由基的生成，從而起到保護(hù)軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用。馬建兵[9]也通過實(shí)驗(yàn)證明提高SOD的活性而能夠清除機(jī)體多余自由基,抑制氧自由基對(duì)軟骨細(xì)胞及基質(zhì)的損害作用,同時(shí)能明顯降低LPO 的含量,防止繼發(fā)性損害,從而起到保護(hù)軟骨及其基質(zhì)免受氧自由基侵害的作用,進(jìn)而延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變。

生長(zhǎng)抑素的生理功能是抑制腦垂體分泌生長(zhǎng)激素，調(diào)節(jié)周圍器官的外分泌及內(nèi)分泌功能，通過抑制感覺神經(jīng)末梢釋放P物質(zhì)而抑制神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)。P物質(zhì)被認(rèn)為是一種神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的介質(zhì)，并能通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞和滑膜細(xì)胞相互作用而破壞關(guān)節(jié)軟骨。生長(zhǎng)抑素通過抑制P物質(zhì)，使I型和Ⅱ型感覺神經(jīng)末梢失去活性而減少疼痛，通過抑制淋巴細(xì)胞的增殖和單核細(xì)胞的趨化性起到抗炎作用[10]。生長(zhǎng)抑素在關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用后，生長(zhǎng)抑素可作用于不同種類的細(xì)胞和組織:抑制滑膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的增殖及單核細(xì)胞(主要為淋巴細(xì)胞)的活化和趨化性;抑制滑膜細(xì)胞釋放前列腺素。此外，生長(zhǎng)抑素還具有收縮血管，減少血漿滲出和水腫;恢復(fù)血清滑液屏障的功能，減少關(guān)節(jié)積液，消除炎癥，從而達(dá)到緩解疼痛，消除腫脹，改善關(guān)節(jié)功能的作用[11]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，生長(zhǎng)抑素還可能通過提高軟骨細(xì)胞超氧化物岐化酶活性，阻止自由基生成來保護(hù)軟骨細(xì)胞。

生長(zhǎng)抑素對(duì)OA 的治療作用機(jī)制是非常復(fù)雜的,本研究提示其可能是通過提高超氧化物歧化酶水平對(duì)OA 產(chǎn)生防治作用的，與透明質(zhì)酸鈉有著相似的療效。透明質(zhì)酸鈉是已投入臨床應(yīng)用多年，經(jīng)臨床證實(shí)對(duì)早期OA 有較好防治作用的藥物,但有著價(jià)格昂貴、不易保存等局限性,而生長(zhǎng)抑素有價(jià)廉、易保存等優(yōu)勢(shì),存在著開發(fā)應(yīng)用的前景。但是由于藥品本身的成分比較復(fù)雜,其中真正的有效成分有哪些? 是否同時(shí)還存在著損傷軟骨的成分? 是否還存在著其他更好的用藥途徑? 還都有待于進(jìn)一步研究。

[1] 王建華，李靖年.骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷與修復(fù)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)矯形外科雜志，2006，6：941-944.

[2] 俞志堅(jiān)，何曉峰，陳勇，等.臭氧對(duì)髓核超微結(jié)構(gòu)影響[J].介入放射學(xué)雜志，2001，10：161-163.

[3] 王賢波，蔣青.大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型的構(gòu)建及其穩(wěn)定性觀察 [J].中國(guó)臨床康復(fù)雜志，2005，972-974.

[4] Jiang HP,Wang DP.Osteoarthritis creataral model [J].Chin J Modern medicina，2004,146:153-156.

[5] Shinriki N,Suzuki Takama K,Fukunaga K,et al.Susceptiblities of plasma antioxidants and erythrocyte constituents to low levels of ozone[J].Haematologia(Budap)，1998，29:229-239.

[6] Bayram H,Sapsford RJ,Abdelaziz MM,et al.OA Effect of ozone and nitrogen dioxide on the release of proinflammatory mediators from bronchial epithelial cells of nonasthmatic subject and atopic asthmmation patients in vitro[J].J Allergy Clin Immunol，2001，107：287-294.

[7]Mtyagi l,Kikuchi H,Hamantshi C.Auto destrcyio of the articular cartilage and free radical mediators[J].J Lab Clin Med,1998,131:146.

[8] 邵敏，陳隨星，牛維，等.補(bǔ)腎活血方對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎組織測(cè)量學(xué)指標(biāo)的影響 [J].安徽中醫(yī)學(xué)院報(bào)，2006，25：31-33.

[9] 馬建兵，沙浩渡，李向陽(yáng)，等.兔實(shí)驗(yàn)性膝關(guān)節(jié)炎的組織病理學(xué)的發(fā)病機(jī)理 [J].中國(guó)矯形外科雜志，2001，8：45-47.

[10] 鄧雪強(qiáng).生長(zhǎng)抑素關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎35例[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥,2009,12:61.

[11] 黃喬?hào)|，何雁冰，陳金生，等.生長(zhǎng)抑素關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療膝關(guān)節(jié)骨性的療效觀察[J].廣東醫(yī)學(xué),2006,27:8-9.