張曙影，李 萍，聞慶平，曲成龍，蔡正旭，郭慧淑

(1.大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 中心實驗室，遼寧 大連 116011; 2.大連大學 附屬中山醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 大連116001)

鈉尿肽是具有生物活性的多聚肽類家族，它包括ANP、BNP、CNP和DNP。這些肽類分布在全身各處發(fā)揮其生理功能，如尿液的排出、血管擴張、調(diào)節(jié)血壓和電解質(zhì)平衡等[1]。D型鈉尿肽(dendroaspis natriuretic peptide,DNP)是最近新發(fā)現(xiàn)鈉尿肽家族的成員，是從一種美洲蛇的蛇毒中提煉出來的由38個氨基酸組成聚肽類物質(zhì)。到目前為止，關(guān)于DNP的研究僅僅局限在心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)。DNP對胃腸動力方面的研究非常少。Kim JH等[2]首次在大鼠的結(jié)腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)DNP并發(fā)現(xiàn)它通過局部的調(diào)質(zhì)調(diào)節(jié)結(jié)腸動力。作者前期研究發(fā)現(xiàn)鈉尿肽能調(diào)節(jié)胃腸動力,而且DNP通過cGMP途徑抑制胃動力[3,4]，但其深入的離子通道機制還不清楚。NP系統(tǒng)類似與NO系統(tǒng)都是產(chǎn)生cGMP的系統(tǒng)，作者以往的研究中發(fā)現(xiàn)SNP可以通過IP3受體介導的鈣庫鈣釋放產(chǎn)生cGMP而達到抑制胃腸動力的作用[5]。因此，本研究考慮到DNP調(diào)節(jié)胃腸動力可能與IP3受體有關(guān)。基于以上的背景,本研究深入探討DNP對胃竇環(huán)形肌細胞上鈣敏感鉀電流[IK(Ca)]的影響，并探討cGMP途徑和細胞內(nèi)鈣庫在其中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞制備

用25%的氨基甲酸乙酯(50 mg/kg)麻醉動物后，迅速剪取胃竇部放入氧飽和的無鈣的PSS緩沖液中漂洗，然后分離環(huán)行肌并將其分割成幾個肌條(1 mm×4 mm)。將肌條放入4℃的K-B液中保存約15 min，之后將其放入裝有36℃消化液的試管中進行孵育。消化液是由0.1%的Ⅱ型膠原酶、0.1%的二硫蘇醇糖、0.15%的胰蛋白抑制劑和0.2%的牛血清白蛋白溶入4 mL無鈣的PSS緩沖液組成的。孵育結(jié)束，將消化好的肌條移入4℃K-B液中保存。

1.2 藥品和溶液

臺氏液成分(mmol/L)：NaCl 147,KCl 4,MgCl2·6H2O 1.05,CaCl2·2H2O 0.42,Na2PO4·2H2O 1.81,Glucose 5.5，以NaOH調(diào)pH值至7.35；PSS成分(mmol/L)：NaCl 134.8,KCl 4.5,MgCl2·6H2O 1.0,CaCl2·2H2O 2.0,Glucose 5.0,HEPES 10.0,以Tris調(diào)pH值至7.40；無鈣PSS的成分(mmol/L)：NaCl 134.8,KCl 4.5,HEPES 10,MgCl21,Glucose 10,以Tris調(diào)pH值至7.40；Kraft-Bruhe液(K-B液)的成分(mmol/L)：EGTA 0.5,HEPES 10,MgCl23,KCl 50,Glucose 10,L-Glutamate 50,Taurine 20,KH2PO4 20,以KOH調(diào)pH值至7.40；記錄IK(ca)電極內(nèi)液的成分(mmol/L)：K-aspartic acid 110,Mg-ATP 5,MgCl2·6H2O 1.0,KCl 20,EGTA 0.1,di-tris-creatine phosphate 2.5,disodium-creatine phosphate 2.5,HEPES 5,以KOH調(diào)pH值至7.30；配制完成后，用1 mL的分裝瓶分裝存放于0℃的冷凍箱中，實驗前解凍使用。

非選擇鉀通道阻斷劑(Tetraethylammonium TEA)配成10 mmol/L，DNP配成0.1、1、10、100 nmmol/L不同濃度。烏苷酸環(huán)化酶抑制劑(LY83583)和CGMP敏感磷酸酯酶抑制劑(Zaparinast)各配成相應(yīng)的濃度。實驗中用到的所有藥品均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 電生理記錄

在實驗前用管口圓滑的滴管輕輕吹打肌條即可得到分離的單細胞。取1滴細胞懸浮液(0.1 mL)平鋪于倒置顯微鏡(Ⅸ-70 Olympus,Japan)鏡臺上的灌流槽底部，待10～15 min細胞沉降至槽底后，用等滲溶液進行灌流(2～3 mL/min)。然后用電阻為2～5 MΩ的玻璃電極進行5～10 GΩ的千兆封接。用傳統(tǒng)全細胞模式記錄膜電流，在電壓鉗制在-60 mV，階躍電壓刺激從-40 mV開始，以每20 mV的階躍幅度去極花至+100 mV，持續(xù)400 ms記錄鈣敏感鉀電流。用相同電極內(nèi)液，電壓牽制在-200 V連續(xù)記錄自發(fā)瞬間外向鉀電流(spontaneous translent outwad ourrents's ToCs)。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤來表示。用同體對照的t檢驗，P<0.05為差異具有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 豚鼠胃竇環(huán)形肌上鈣敏感鉀電流和自發(fā)瞬間外向鉀電流的記錄

SToCs與IK(ca)同樣是鈣敏感鉀電流，前者是睡間外向鉀電流[6]，可以連續(xù)記錄。用非選擇性鉀通道阻斷劑TEA和特異性鈣敏感鉀通道阻斷劑CHTX檢測Stocs從而確定記錄到的是否是IK(Ca)，見圖1。

圖1非選擇性鉀通道阻斷劑TEA和特異性鈣敏感鉀通道阻斷劑CHTX對豚鼠胃竇環(huán)形肌上鈣敏感鉀電流的影響

2.2 DNP對豚鼠胃竇環(huán)形肌細胞IK(ca)的影響

DNP明顯增加IK(Ca)，并具有劑量依賴關(guān)系，0.1、1、10和100 nmol/L的DNP增加IK(Ca)的幅度分別為(16.7±1.12)%、(26.5±2.3)%、(46.2±3.3)%和(58.3±3.7)%。10 nmol/L的DNP明顯增加STOCs的幅度和頻率，見圖2。

圖2不同濃度的DNP增加豚鼠胃竇環(huán)形肌上鈣敏感鉀電流的劑量依賴關(guān)系，與上一個濃度組相比，a：P<0.01

2.3 細胞外鈣對DNP增加IK(Ca) 的影響

IK(Ca)的激活與細胞外鈣的內(nèi)流有密切關(guān)系。為探討細胞外鈣是否參與DNP增加IK(Ca)過程，將細胞外液換成無鈣液后觀察10 nmol/L的DNP對IK(Ca)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNP仍然增加IK(Ca)，其增加幅度為(47.1±2.7)%(圖3)。由于L型鈣通道是細胞外鈣離子內(nèi)流的主要通道，因此，作者用L型鈣通道阻斷劑尼卡地平后發(fā)現(xiàn)尼卡地平明顯抑制IK(Ca),但不影響DNP對IK(Ca)的增加作用。見圖4。

圖3細胞外鈣無鈣對DNP增加豚鼠胃竇環(huán)形肌上鈣敏感鉀電流的影響，與對照組相比，a：P<0.05，b：P<0.01

圖4 L型鈣通道阻斷劑對DNP增加豚鼠胃竇環(huán)形肌上鈣敏感鉀電流的影響，與PSS組或nicardipine組比較，

a：P<0.01

2.4 細胞內(nèi)鈣庫鈣釋放與DNP增加IK(Ca)之間的關(guān)系

鈣敏感鉀通道能被細胞內(nèi)IP3受體介導的鈣庫和Rydonine受體介導的鈣庫釋放的鈣所激活。因此，本文觀察了細胞內(nèi)這兩大鈣庫是否參與DNP增加IK(Ca)和STOCs的過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IP3受體阻斷劑肝素明顯抑制DNP增加IK(Ca)和STOCs(圖5)，而Rynodine是Rynodine受體介導鈣庫的鈣的耗竭劑，用Rynodine后STOCs先短暫增加，這是Rynodine受體介導鈣庫鈣耗竭過程，耗竭完畢后給予其鈣庫的激動劑Cafeine后發(fā)現(xiàn)STOCs不再增加。此時再給予DNP，發(fā)現(xiàn)DNP仍然可以增加STOCs，見圖6。

圖5 IP3受體阻斷劑肝素對DNP增加STOCs的影響。與對照組，c：P<0.01

圖6 Rynodine受體介導的鈣庫與DNP增加STOCs之間關(guān)系，與對照組相比，d：P<0.01

2.5 cGMP對DNP引起STOCs 的作用

為了進一步探討cGMP在DNP增加STOCs過程中的作用，從cGMP生成減少和降解減少兩方面證實了cGMP確實參與DNP對豚鼠胃竇環(huán)行肌STOCs的增加過程。鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑LY83583明顯抑制DNP對STOCs的增加作用(圖7)，而cGMP敏感的磷酸酯酶抑制劑卻增強其作用(圖8)。

3 討 論

本實驗發(fā)現(xiàn)在豚鼠胃竇環(huán)形肌上DNP增加IK(Ca)和STOCs，細胞外換成無鈣液或尼卡地平均不能抑制DNP引起的IK(Ca)的增加。肝素明顯抑制DNP引起的STOCs的增加而Rynodine無此效應(yīng)。另外，鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑LY83583抑制DNP引起的STOCs的增加而cGMP敏感磷酸酯酶抑制劑Zaparinast卻增強DNP引起的STOCs的增加。

在平滑肌上主要有三種鈣敏感鉀通道：大電導和中等電導的鉀通道可以被2 mmol/L的TEA和200 nmol/L的CHTX阻斷而小電導的鉀通道不能被5 mmol/L的TEA阻斷而對apamin敏感。本研究發(fā)現(xiàn)鈣敏感鉀通道可被4 mmol/L TEA和200 mmol/L CHTX阻斷，因此是大電導鉀通道。給予去極化刺激時平滑肌上可記錄到三種鉀通道：鈣敏感鉀通道[IK(Ca)]、延遲整流型鉀通道[IK(V)]和瞬間外向鉀通道I(TO)[7]。以往研究表明在豚鼠胃竇環(huán)形肌上只能記錄到兩種鉀通道即IK(Ca)和IK(V)[8]。為了去掉IK(V)成分，采用了3種方法：①電極內(nèi)液中中加入0.1 mmol/L的EGTA;②細胞外液中加入10 mmol/L的4-AP;③TEA和CHTX明顯阻斷STOCs(圖1A、B)。鈣敏感鉀通道與平滑肌的收縮有密切關(guān)系。以往的研究表明，NP能通過激活I(lǐng)K(Ca)舒張平滑肌。ANP可以通過激活I(lǐng)K(Ca)舒張人呼吸道平滑肌，在此過程中cGMP系統(tǒng)參與此過程。CNP通過激活大電導的IK(Ca)引起犬類股靜脈血管平滑肌的舒張，cGMP系統(tǒng)參與此過程。BNP通過激活I(lǐng)K(Ca)和啟動NO產(chǎn)生而實現(xiàn)動脈血管平滑肌的舒張。但到目前為止，沒有關(guān)于IK(Ca)與胃腸動力之間關(guān)系的報道。以往作者的研究中發(fā)現(xiàn)DNP抑制豚鼠胃竇環(huán)形肌自發(fā)性收縮活動而在本研究中又發(fā)現(xiàn)DNP明顯增加IK(Ca)和STOCs并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(圖2)。

圖7鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑LY83583對DNP增加STOCs的影響，與對照組相比，e：P<0.05;與DNP組相比，f：P<0.01

圖8 cGMP敏感磷酸酯酶抑制劑Zaparinast對DNP增加STOCs的影響。與對照組相比，g:P<0.01

IK(Ca)受到細胞內(nèi)外鈣離子的調(diào)節(jié)。為證明這些鈣動員與DNP增加IK(Ca)之間的關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)，在細胞外缺乏鈣離子的情況下觀察DNP的作用(圖3、4)。結(jié)果顯示DNP在細胞外缺乏鈣離子時仍然增加IK(Ca)。另外，L型鈣通道阻斷劑尼卡地平能抑制鈣電流但不能抑制DNP引起的IK(Ca)的增加。這表明細胞外的鈣離子不參與DNP增加IK(Ca)的過程。

平滑肌細胞內(nèi)鈣庫主要有兩種：IP3受體介導的鈣庫和Rynodine受體介導的鈣庫。研究表明，SNP可通過啟動IP3受體介導的鈣庫的鈣釋放增加IK(Ca)引起動脈血管平滑肌的舒張[9]。研究表明，在心血管系統(tǒng)牽張刺激引起的BNP基因的表達需ynodine受體介導的鈣庫鈣釋放，從而使神經(jīng)鈣蛋白和神經(jīng)鈣蛋白依賴的激酶激活而實現(xiàn)。這些研究都表明平滑肌舒張和細胞內(nèi)鈣庫釋放鈣之間有密切的關(guān)系。與本研究結(jié)果一致：DNP通過激活細胞內(nèi)IP3受體介導的鈣庫的鈣釋放激活I(lǐng)K(Ca)(圖5、6)。

DNP實現(xiàn)很多生理功能是通過激活cGMP途徑。研究報道DNP通過啟動cGMP系統(tǒng)舒張人動脈和靜脈平滑肌。DNP也可通過cGMP產(chǎn)生引起H9C2細胞凋亡。本研究中發(fā)現(xiàn)鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑LY83583抑制cGMP產(chǎn)生削弱DNP引起的STOCs的增加(圖7)，而cGMP敏感的磷酸酯酶抑制劑使cGMP降解減弱而使細胞內(nèi)cGMP濃度增加從而使DNP增加IK(Ca)的程度加強(圖8)。這些數(shù)據(jù)顯示，DNP通過激活I(lǐng)P3受體介導的鈣釋放和增加cGMP產(chǎn)生引起IK(Ca)增加，從而引起豚鼠胃竇環(huán)形肌舒張。

DNP通過細胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生和IP3受體介導鈣庫的鈣釋放，使豚鼠胃竇環(huán)形肌細胞上鈣敏感鉀電流增加，進而使細胞超極化使平滑肌舒張。

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