萬(wàn) 晶,田 舸,田 燕,高 萌,艾 群，李 鎮(zhèn),梅 林

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連116027;2.大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連116044;3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 中醫(yī)科，遼寧 大連116027)

長(zhǎng)期臨床實(shí)踐和藥理、藥效實(shí)驗(yàn)研究表明[1]，雷公藤多苷(Glycosides of Tripterygium wilfordii Hook.f.GTW)作用方式獨(dú)特，具有類皮質(zhì)激素的抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等作用，對(duì)風(fēng)濕性疾病及腎臟疾病等療效顯著。但其常見(jiàn)的消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的毒副作用又一直困擾著醫(yī)藥工作者[2]。因此，如何降低GTW毒性甚至增強(qiáng)其療效逐漸成為學(xué)者們研究的焦點(diǎn)。許多學(xué)者從中藥方劑配伍入手，通過(guò)動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)，為GTW減毒增效研究打開(kāi)了新的局面[3]。具有逐瘀、活血、調(diào)經(jīng)等作用的當(dāng)歸，中醫(yī)稱之為“女科之圣藥”，專治月經(jīng)不調(diào)，閉經(jīng)，痛經(jīng)等婦科疾病，是既能保胎，又能抗氧化及延緩衰老的女性良藥[4]。作者認(rèn)為，在正確選擇藥物的前提下，藥物的應(yīng)用方式同樣非常重要，不同的給藥方式是否均能拮抗雷公藤多苷所致生殖系統(tǒng)的毒性尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究進(jìn)行了當(dāng)歸注射液(Angelica Injection,AI)口服給藥與元穴給藥對(duì)比實(shí)驗(yàn)，報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材 料

酶標(biāo)儀(Thermo Electron Corporation,Type：354)， 光學(xué)顯微鏡(BX41，日本奧林巴斯公司)，Sartorius BS 110S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，雷公藤多苷片(浙江普洛康裕天然藥物有限公司，090504 10 mg/片)， 瑞氏染色劑(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)，吉姆薩染色劑(北京華美生科生物技術(shù)有限公司)， 小鼠雌二醇(E2)ELISA試劑盒(Adlitteram Diagnostic Laboratories，Inc.)，AI注射液(36.2 mg/mL)：大連醫(yī)科大學(xué)藥劑學(xué)教研室提供，其他試劑為市售分析純。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康成熟8周齡雌性小鼠24只，體重25～28 g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組:實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組(制備GTW毒性作用)、AI穴位給藥組和AI口服給藥組。全部小鼠每天早上9點(diǎn)進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，連續(xù)10 d。具體操作:取生理鹽水3～5滴，滴入小鼠陰道，反復(fù)抽吸3次，取陰道分泌物1滴均勻涂于載玻片上，自然晾干；用95%甲醇液固定5 min,自然晾干；用瑞氏染色液染色5～8 min，清水沖洗；再用吉姆薩染色液染色5～8 min，沖洗，自然晾干；置于光學(xué)顯微鏡×100下觀察小鼠動(dòng)情周期變化情況[5]。篩選出有正常動(dòng)情周期者為受試動(dòng)物，隨機(jī)分組，每組6只。

1.2.2 給藥方法及劑量:(1)正常組:按0.1 mL/10 g體重灌服生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥8 d；(2) 模型組:將1000 mg雷公藤多苷片溶于250 mL生理鹽水配制為4 mg/ mL溶液，按40 mg/kg體重灌胃GTW[6]， 1次/d，連續(xù)給藥8 d[7]；(3)AI穴位給藥組:按(2)項(xiàng)下口服GTW的同時(shí)，0.1 mL /10 g體重關(guān)元穴注射AI ，1次/d，連續(xù)給藥8 d；(4)AI口服給藥組:按(2)項(xiàng)下口服GTW的同時(shí)，0.1 mL/10 g體重灌胃AI，1次/d，連續(xù)給藥8 d。

1.2.3 標(biāo)本的采集與處理:(1) 血樣的采集與處理:處死小鼠前稱取體重，采用眼球摘除取血法，全血于室溫下放置1 h，再以2000 r/min離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)接免疫吸附法測(cè)定血清E2含量[8]。(2) 組織標(biāo)本的采集與處理:稱取小鼠體重，取血處死后將卵巢、子宮分別取出，剝離周圍附著組織，在電子分析天平上稱取濕重，按以下公式計(jì)算卵巢指數(shù)與子宮指數(shù)[9]。

卵巢指數(shù)=卵巢濕重(mg)/體重(g)×100%

子宮指數(shù)=子宮濕重(mg)/體重(g)×100%

1.2.4 觀察指標(biāo):行為學(xué)(飲食、皮毛光澤、精神狀態(tài)、糞便)；體重；血清學(xué)；動(dòng)情周期；卵巢指數(shù)；子宮指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)觀察

模型組與正常組比較:小鼠攝食量、飲水量減少，大便量少且較軟，毛少且光澤干枯，活動(dòng)頻度減少，精神較差；AI穴位給藥組小鼠精神及活動(dòng)度較好，其一般情況與正常組無(wú)明顯區(qū)別；AI口服給藥組小鼠較之正常組小鼠大便較稀，毛少光澤，活動(dòng)頻度較少、精神較差，但進(jìn)食、飲水情況基本相同，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 體重變化

各組體重變化的比較見(jiàn)表2，由表中數(shù)據(jù)可以看出，模型組與正常組比較體重明顯下降，體重測(cè)量值差異具有顯著性意義(P>0.05)。AI穴位給藥組與模型組相比，小鼠體重測(cè)量值差異具有顯著性意義(P<0.05)；AI口服給藥組與模型組相比，小鼠體重測(cè)量值差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。AI穴位給藥可抑制GTW造成的小鼠體重下降，而AI口服給藥則不能抑制。

表1 各組小鼠的行為學(xué)比較Tab 1 Comparision of the mice behavior in each group

表2 各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間的體重變化Tab 2 Changes of the mice weight in each group during experiment (g)

1)與正常組相比，P<0.05; 2)與模型組相比，P<0.05

2.3 動(dòng)情周期觀察

本實(shí)驗(yàn)采用的小鼠正常動(dòng)情周期為4～7 d，包括動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期。動(dòng)情前期陰道涂片中有核上皮細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，它們有的是單個(gè)的，有的呈片狀，并有少量白細(xì)胞，見(jiàn)圖1a；動(dòng)情期涂片中有很多無(wú)核的角化鱗狀細(xì)胞，細(xì)胞大而扁平，邊緣不整齊，視野中看不到或很少白細(xì)胞與上皮細(xì)胞，見(jiàn)圖1b；動(dòng)情后期涂片中角化上皮細(xì)胞減少，出現(xiàn)許多白細(xì)胞及有核上皮細(xì)胞，見(jiàn)圖1c；動(dòng)情間期小鼠陰道粘膜薄，白細(xì)胞從粘膜內(nèi)游離出來(lái)，使陰道涂片中幾乎全部為白細(xì)胞，見(jiàn)圖1d；灌服雷公藤多苷8 d后，可造成小鼠動(dòng)情周期的紊亂，見(jiàn)表3。這主要表現(xiàn)為連續(xù)數(shù)天陰道分泌物中出現(xiàn)大量白細(xì)胞，偶有較小的有核扁平上皮細(xì)胞，見(jiàn)圖1e。通過(guò)對(duì)小鼠動(dòng)情周期的觀察可確定，灌服雷公藤多苷的同時(shí)AI口服給藥只可恢復(fù)部分小鼠的動(dòng)情周期。灌服雷公藤多苷的同時(shí)AI關(guān)元穴給藥可使大部分小鼠動(dòng)情周期恢復(fù)。

表3 實(shí)驗(yàn)后各組小鼠動(dòng)情周期的狀態(tài)

2.4 實(shí)驗(yàn)小鼠雌激素E2的比較

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果見(jiàn)表4、圖2。

表4 雌二醇(E2)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定表Tab 4 The results of estradiol(E2) standard curve

圖1 小鼠動(dòng)情周期的陰道涂片觀察 (×100)

圖2 雌激素E2的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 2 The standard curve of extrogen E2

2.4.2 各組小鼠雌激素E2的比較:模型組與正常組相比，E2值明顯下降，差異具有顯著性意義(P<0.05)。AI穴位給藥組與模型組相比，E2值明顯上升，差異具有顯著性意義(P<0.05)；AI口服組與模型組相比，E2值雖有上升，但差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。由此可以看出，AI關(guān)元穴給藥后，可使卵巢早衰的小鼠E2值恢復(fù)正常，而AI口服給藥則不能達(dá)到相同的療效(表5)。

2.5 實(shí)驗(yàn)小鼠子宮指數(shù)的比較

模型組與正常組相比，子宮指數(shù)測(cè)量值差異具有顯著性意義(P<0.05)。AI穴位給藥組與模型組相比，子宮指數(shù)測(cè)量值差異具有顯著性意義(P<0.05)；AI口服給藥組與模型組相比，子宮指數(shù)測(cè)量值差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。AI關(guān)元穴給藥，可使卵巢早衰的小鼠子宮指數(shù)值恢復(fù)正常，而AI口服給藥不能達(dá)到相同的療效(表6)。

表5各組小鼠雌激素E2的比較

Tab 5 Comparision of the mice extrogen E2 level in each group

組別nE2濃度(pg/mL)正常組6617．04±29．70模型組6298．27±41．531)AI口服給藥組6333．80±50．33AI穴位給藥組6562．30±85．962)

1)與正常組相比，P<0.05;2)與模型組相比，P<0.05

表6 各組小鼠子宮指數(shù)的比較Tab 6 Comparision of the mice uterus index in each group

1)與正常組相比，P<0.05;2)與模型組相比，P<0.05

2.6 實(shí)驗(yàn)小鼠卵巢指數(shù)的比較

模型組與正常組相比，卵巢指數(shù)測(cè)量值差異具有顯著性意義(P<0.05)。AI穴位給藥組與模型組相比，卵巢指數(shù)測(cè)量值差異具有顯著性意義(P<0.05)；AI口服給藥組與模型組相比，卵巢指數(shù)測(cè)量值差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。AI關(guān)元穴給藥，可使卵巢早衰的小鼠卵巢指數(shù)值恢復(fù)正常，而AI口服給藥不能達(dá)到相同的療效(表7)。

表7 各組小鼠卵巢指數(shù)的比較Tab 7 Comparision of the mice ovarian index in each group

1)與正常組相比，P<0.05;2)與模型對(duì)照組相比，P<0.05

3 討 論

雷公藤多苷具有顯著的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用。臨床上用于風(fēng)濕熱閼，毒邪阻滯所致的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腎病綜合癥，白塞氏三聯(lián)癥，麻風(fēng)反應(yīng)，自身免疫性肝炎等疾病。但是雷公藤制劑在起到治療作用的同時(shí)，對(duì)人體毒副作用較明顯，比如有惡心、食欲減退，白細(xì)胞、血小板減少，月經(jīng)紊亂，精子減少等癥狀。其中最主要的是對(duì)生殖系統(tǒng)的毒性，年輕女性短期服用(1～3個(gè)月)可至經(jīng)期紊亂，長(zhǎng)期服用(3～5年)，可致完全閉經(jīng)。

當(dāng)歸味甘微辛，氣香液濃，性溫，歸心、肝、脾三經(jīng)，為生血活血之主藥，加之又能宣通氣分，使氣血各有所歸，故名之曰當(dāng)歸?！端幤坊x》云：“凡藥體性，分根升，梢降，中守，此獨(dú)一物而全備。頭補(bǔ)血上行，身養(yǎng)血守中，梢破血下行，全活血運(yùn)行周身。”因此，當(dāng)歸為婦女調(diào)經(jīng)、胎前產(chǎn)后之要藥，所以臨床上廣泛應(yīng)用。

“穴位注射”又稱“水針療法”， 是中西醫(yī)結(jié)合的治療方法。它形成于50年代初期，首先應(yīng)用于封閉療法，后被臨床廣泛應(yīng)用。“穴位注射”是根據(jù)所患疾病，按照穴位的治療作用和藥物的藥理作用，選用相應(yīng)的腧穴和藥物，操作時(shí)，將注射針刺入穴位，作提插手法，使其得氣，抽吸無(wú)回血后再將藥液緩緩注入穴位，激發(fā)經(jīng)絡(luò)與穴位，從而起到穴位、針刺、藥物三結(jié)合，以充分發(fā)揮腧穴和藥物對(duì)疾病的綜合作用，從而達(dá)到治療疾病目的的一種方法。經(jīng)臨床觀察效果頗佳[10,11]。

本實(shí)驗(yàn)比較了AI關(guān)元穴給藥和AI口服給藥對(duì)GTW所致小鼠生殖系統(tǒng)毒性的拮抗作用，結(jié)果表明，(1)當(dāng)歸這個(gè)被中醫(yī)稱之為“女科之圣藥”的傳統(tǒng)中藥在拮抗雷公藤多苷所致生殖系統(tǒng)的毒性方面是值得考慮的；(2)等劑量用藥條件下，穴位注射較口服途徑給藥有效，再次驗(yàn)證水針療法是一種很有前途的治療方法，同時(shí)提示GTW口服給藥所致小鼠生殖系統(tǒng)毒性的副作用是可以通過(guò)聯(lián)合用藥手段拮抗的。

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