楊 麗，馬興龍，李春樹

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 ICU病房，遼寧 大連 116027)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是臨床常見病，死亡率極高。肺泡表面活性物質(zhì)(PS)的表達(dá)減少是ALI的重要機(jī)制之一。海水淹溺性肺損傷是由于海水淹溺后肺泡腔內(nèi)PS被分解破壞，同時肺泡滲出液的稀釋又進(jìn)一步降低其濃度，提高肺泡表面張力，導(dǎo)致肺損傷。因此，提高PS的含量是治療ALI的關(guān)鍵之一。

PS主要包括90%的脂質(zhì)，8%～10%的特異性蛋白。脂質(zhì)中80%～90%是磷脂，而其中80%是磷脂酰膽堿。磷脂酰膽堿的50%～60%為DSPC，DSPC是降低肺泡表面張力的主要成分。已有研究證明，ALI大鼠的肺泡灌洗液(BALF)中總磷脂(TPL)和磷脂酰膽堿(DSPC)明顯低于正常組[1]。

鹽酸氨溴索可以促進(jìn)肺泡表面活性物質(zhì)的生成，在臨床用于治療多種肺泡表面活性物質(zhì)減少的疾病。最近文獻(xiàn)報道，增加鹽酸氨溴索的劑量，每天最多可以達(dá)到1 g，對肺泡表面活性物質(zhì)的增加更有益[2]，但并沒有明確的指標(biāo)證明氨溴索的劑量與肺泡表面活性物質(zhì)的生成的相關(guān)性。雖然在德國有文獻(xiàn)報道最大計量可以應(yīng)用到3 g/d，但大劑量使用氨溴素尚缺乏理論依據(jù)。同時大劑量使用氨溴索增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時療效并不確定。因此，確定鹽酸氨溴索的使用量與肺泡表面活性物質(zhì)增長相關(guān)性對于指導(dǎo)臨床用藥有著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測不同劑量的鹽酸氨溴索對海水淹溺大鼠肺泡表面活性物質(zhì)的影響，嘗試明確藥物劑量對于肺泡表面活性物質(zhì)生成的作用。

1 材料和方法

1.1 動物分組與模型制備

健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。海水取自東經(jīng)121.6°，北緯 38.5°的黃海海域，鹽度3%～3.5%。排除標(biāo)準(zhǔn)：麻醉過量和氣管內(nèi)注射窒息等意外死亡，支氣管肺泡灌洗致肺泡破裂，BALF回收率低于80%的大鼠。

將40只雄性SD大鼠隨機(jī)均分為8組，正常對照組為未經(jīng)海水淹溺實(shí)驗(yàn)的正常大鼠，其余7組按照氨溴索的劑量0、1、4、8、12、16、20 mg/kg，全部在淹溺后4 h采取標(biāo)本。 動物用硫噴妥鈉溶液腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，頸部正中切口，分離氣管。氣管內(nèi)注入海水3 mL/kg，建立淹溺性肺水腫大鼠模型。在模型建立的同時按照分組情況給大鼠注射氨溴索。在模型建立4 h后腹腔注射肝素400 U/kg，并處死動物，打開腹腔，從右心室以5 mL/min的速度注射生理鹽水15 mL，灌注肺血管，氣管插管，行支氣管肺泡灌洗，注入預(yù)冷的4 ℃生理鹽水40 mL/kg來回3次后回收灌洗液，共2次，將收集的支氣管灌洗液(BALF)計量，計算回收率，立即4℃,12000 r/min離心10 min， -20℃保存上清。

1.2 BALF中TPL,DSPC的測定

總蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(0.5 mg/mL)試劑盒及磷材料品(0.04 mg/mL)試劑盒均由上海生物制品研究所提供。分別用Bartlett法和Mason法測定TPL和DSPC。測定步驟如下：(1) 取2份1 mL樣品，分別作為TPL和DSPC樣本(樣本1和2)，(2)萃?。杭尤肷睇}水1 mL，分別加入1 mL甲醇和1 mL氯仿，(3)震蕩3～5 min，靜置10 min，取下層(氯仿層),盡可能完整，氮?dú)獯蹈?，?biāo)本1待消化測TPL，(4)四氯化鋨氧化和過柱；樣本2加0.5 mL四氯化鋨，室溫下反應(yīng)15 min，氮?dú)獯蹈刹⒎謩e用1液和2液過柱，收集洗脫液5 mL，氮?dú)獯蹈?，待消化測DSPC，(5)消化:待消化標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)磷(按0.5、1、2、4 μg分4管加樣)及空白管各加入0.5 mL 5 mol/L硫酸和0.5 mL雙蒸水后置200℃烤箱1 h后取出，冷卻后加入3 mL試劑盒中D液，100℃水浴10 min后立即終止反應(yīng)，(6)測光密度值(D)：分光光度計波長設(shè)定為800 nm，靈敏度2擋，(7)計算：磷脂含量(mg/mL)=D樣本÷D標(biāo)準(zhǔn)品×標(biāo)準(zhǔn)品磷含量×25，(8)用BALF總量和動物體質(zhì)量修正測定結(jié)果，即TPL或DSPC(mg/kg)=磷脂含量(mg/mL)×BALF 總量(mL)÷動物體質(zhì)量(kg)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大鼠淹溺后情況

實(shí)驗(yàn)組的7組大鼠淹溺后4 h均能存活。8組間體重及存活系數(shù)差異無顯著性意義(P>0.1)。

2.2 不同劑量的氨溴索對模型大鼠BALF中TPL和DSPC的影響

8組大鼠BALF中TPL和DSPC的變化見表1。鹽酸氨溴索治療組肺泡灌洗液中的TPL，DSPC的含量隨鹽酸氨溴索劑量增大而增加，在12 mg/kg時以上指標(biāo)可與正常對照組(無淹溺組)相似，并且隨著氨溴索劑量的增加TPL,DSPC也在增高，與0 mg/kg組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。

3 討 論

表1 各組中TPL和DSPC的變化Tab 1 The change in DSPC and TPL by every group

1) 與對照組比較，P<0.05；2) 與0 mg/kg比較，P<0.05

海水淹溺可引起肺毛細(xì)血管內(nèi)皮的損傷。毛細(xì)血管內(nèi)皮的損傷引起血管通透性的增加，形成肺間質(zhì)和肺泡水腫，是急性肺損傷的一種表現(xiàn)。大量動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，急性肺損傷的病理基礎(chǔ)之一是肺泡表面活性物質(zhì)的減少[1]。海水淹溺所致的肺泡上皮的損傷同樣可以引起肺泡表面活性物質(zhì)的合成減少或活性降低[3，4]。因此，提高PS表達(dá)可以改善肺的順應(yīng)性，有效緩解海水淹溺性肺損傷。雖然補(bǔ)充外源性肺泡表面活性物質(zhì)可能會改善肺的順應(yīng)性，但目前批準(zhǔn)用于臨床的PS制劑價格昂貴，很難在臨床推廣使用。[5]。

氨溴素具有刺激肺泡II型上皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器發(fā)育，促進(jìn)PS的生物合成和分泌的作用。同時，氨溴素還可以通過抗氧化，減少炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子生成，對ALI有一定的防治作用[6，7]。本實(shí)驗(yàn)顯示應(yīng)用氨溴索后與未治療的對照組(0 mg/kg)相比，鹽酸氨溴索治療組肺泡灌洗液中的TPL，DSPC的含量隨鹽酸氨溴索劑量增大而增加，在12 mg/kg時以上指標(biāo)可與正常對照組(無淹溺組)相似，并且隨著氨溴索劑量的增加TPL,DSPC也在增高，與0 mg/kg組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。其升高對急性肺損傷的治療是否存在有利因素還有待進(jìn)一步證實(shí)。同時，氨溴索12 mg/kg的劑量是否是使肺泡表面活性物質(zhì)最優(yōu)化的穩(wěn)態(tài)濃度也是下一步需要關(guān)注的問題。

本研究結(jié)果表明，使用鹽酸氨溴索可提高海水淹溺性大鼠的肺泡表面活性物質(zhì)，存在量-效關(guān)系。隨著肺泡表面活性物質(zhì)的增加，是否存在相應(yīng)的病理改善和癥狀的緩解也是作者正在研究的問題[9]。

[1] 許峰，何勇，匡鳳梧，等. ALI大鼠肺表面活性物質(zhì)及肺表面活性物質(zhì)蛋白的研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，29(2)：131-133.

[2] 劉輝，王國軍，丁正年. 外源性肺泡表面活性物質(zhì)對ALI治療效果及量效關(guān)系的研究[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，自然科學(xué)版，2005，25(3)：176-179.

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