劉書亮，王燚，葉勁松，楊勇，陳荀，廖哲

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安，625014) 2(四川北牧南江黃羊集團(tuán)有限公司，四川 南江縣，636600)

肉品發(fā)酵劑中優(yōu)勢(shì)菌群——乳酸菌的存在，保障了發(fā)酵肉制品的食用安全性，而葡萄球菌對(duì)產(chǎn)品的最終顏色和風(fēng)味形成起到較大的作用［1］。為了獲得優(yōu)良的菌種作為肉品發(fā)酵劑，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了較多的研究。Miralles［2］、Aymerich［3］等對(duì)西班牙發(fā)酵香腸，Coppola R［4］、Parente［5］等對(duì)意大利傳統(tǒng)發(fā)酵香腸，Papamanoli［6］對(duì)希臘自然發(fā)酵香腸，F(xiàn)ontana［7］對(duì)阿根廷發(fā)酵干香腸等進(jìn)行了香腸菌相研究并獲得一些肉品發(fā)酵劑菌種。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)較多研究者對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品菌相進(jìn)行初步研究和(/或)獲得了肉品發(fā)酵劑的一些候選菌株［8－12］。最近，有報(bào)道顯示，某些乳酸菌具有一定抗氧化活性［13－16］。腌臘肉制品的氧化酸敗是其變質(zhì)的主要原因之一，添加抗氧化劑可一定程度地抑制肉制品的脂肪氧化［17］。若能獲得具有抗氧化能力的肉品發(fā)酵劑乳酸菌將是解決肉品氧化變質(zhì)的另一條有效途徑，但目前關(guān)于抗氧化肉品發(fā)酵劑乳酸菌的篩選尚鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以四川傳統(tǒng)腌臘肉制品中的乳酸菌為篩選菌源，按照肉品發(fā)酵劑要求初篩，再以其抗氧化能力為復(fù)篩指標(biāo)，獲得具有較強(qiáng)抗氧化能力的菌株，研究其生物學(xué)特性和進(jìn)行菌種鑒定，為功能性肉品發(fā)酵劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

乳酸菌58株，分離于四川傳統(tǒng)腌臘肉制品;木糖葡萄球菌S02(Staphylococcus xylosus S02)分離于四川臘肉，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良MRS固體(液體)、MSA、MSM培養(yǎng)基，系列篩選培養(yǎng)基(耐鹽、耐亞硝酸鹽、氨基酸脫羧酶、硝酸鹽還原、產(chǎn)氨、產(chǎn)H2S和產(chǎn)氣等試驗(yàn));各種生化鑒定培養(yǎng)基(各種糖(醇)類發(fā)酵培養(yǎng)基，七葉靈水解、淀粉水解、甲基紅(M.R)、V-P、吲哚和明膠液化等試驗(yàn)的培養(yǎng)基)［18］。

1.1.3 主要藥品試劑

2× long Taq PCR MasterMix、DNA MakerⅢ購(gòu)自北京天為時(shí)代科技有限公司;Bacterial DNA out抽提試劑盒購(gòu)自四川綿陽(yáng)天澤基因工程有限公司;16S rDNA的 PCR擴(kuò)增引物(上游引物3'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5';下游引物 3'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-5')由上海 invitrogen公司合成;二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)購(gòu)自Sigma公司;其他試劑均為分析純。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小白鼠及飼料購(gòu)自四川簡(jiǎn)陽(yáng)簡(jiǎn)城比爾動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，合格證號(hào):SCXC(川)2004－15。

1.2 方法

1.2.1 肉品發(fā)酵劑乳酸菌初篩

將待測(cè)乳酸菌進(jìn)行耐鹽、耐亞硝酸鹽、接觸酶、氨基酸脫羧酶、硝酸鹽還原酶、產(chǎn)氨、產(chǎn)H2S、產(chǎn)氣和產(chǎn)黏液試驗(yàn)［18］，確定是否符合肉品發(fā)酵劑的要求。

1.2.2 抗氧化肉品發(fā)酵劑乳酸菌復(fù)篩

1.2.2.1 乳酸菌清除羥自由基(·OH)的測(cè)定

按照張江巍［19］的方法制備乳酸菌無(wú)細(xì)胞提取物;按照劉駿［20］的方法測(cè)定乳酸菌發(fā)酵上清液和無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)·OH的清除率。

1.2.2.2 乳酸菌清除DPPH·的測(cè)定

參照 Singh［21］、Lin［16］等方法(略有改進(jìn))。取樣液0.3 mL于比色管中，加入無(wú)水乙醇至3 mL，再加入0.1 mmol/L DPPH·試劑1 mL，強(qiáng)烈振蕩后避光室溫靜止30min，以溶劑調(diào)0點(diǎn)，用1 mL比色皿于517 nm處分別測(cè)定各反應(yīng)液的吸光值A(chǔ)i。同時(shí)，測(cè)定溶劑和DPPH·試劑的吸光度Ac，樣液和溶劑的吸光度Aj。平行測(cè)定3次。按下式計(jì)算:

1.2.3 抗氧化乳酸菌菌株的生物學(xué)特性

1.2.3.1 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將篩選出的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)72 h，每隔2 h測(cè)定其OD600和pH值。同時(shí)以空白MRS作對(duì)照。

1.2.3.2 菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)情況

1.2.3.3 菌株間的拮抗試驗(yàn)

將乳酸菌LS85對(duì)木糖葡萄球菌S02做拮抗試驗(yàn)。按接種量1%(菌液濃度為1.5×107CFU/mL)接種于MSM培養(yǎng)基中，30℃混合培養(yǎng)72 h，每12 h測(cè)定pH值及乳酸菌數(shù)和葡萄球菌數(shù)。乳酸菌數(shù)和葡萄球菌數(shù)分別采用改良MRS和MSA選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。

1.2.3.4 菌株活菌液的急性毒性試驗(yàn)

乳酸菌LS85的24 h培養(yǎng)液經(jīng)5 000 r/min離心20 min，收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌數(shù)至1.5×108CFU/mL。取昆明種小白鼠20只，按照隨機(jī)分組原則分為2組，每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)組按0.2 mL/10 g BW，將乳酸菌LS85的活菌液經(jīng)口灌胃給小鼠;對(duì)照組給予相同劑量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)前禁食過(guò)夜，但保證正常飲水。灌胃后恢復(fù)正常飲食。試驗(yàn)期限為15 d。每天觀察記錄小鼠飲水、進(jìn)食、活動(dòng)及死亡情況。

1.2.4 菌株的鑒定

參照文獻(xiàn)［18］，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)及分子遺傳學(xué)(16S rDNA)鑒定LS85菌株，確定其種屬分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉品發(fā)酵劑乳酸菌的初篩情況

按照肉品發(fā)酵劑篩選標(biāo)準(zhǔn)，源于四川傳統(tǒng)腌臘肉制品中的58株乳酸菌的初篩結(jié)果表明，符合耐6%食鹽、耐100 mg/L亞硝鹽以及接觸酶、氨基酸脫羧酶、硝酸鹽還原酶、產(chǎn)氨、產(chǎn)H2S、產(chǎn)氣和產(chǎn)黏液試驗(yàn)均為陰性的菌株僅有8株，符合率為13.8%(8/58)。

2.2 抗氧化肉品發(fā)酵劑乳酸菌的復(fù)篩情況

先后以清除·OH能力和DPPH·為抗氧化能力的篩選指標(biāo)對(duì)符合肉品發(fā)酵劑篩選標(biāo)準(zhǔn)的8株乳酸菌進(jìn)行了復(fù)篩。8株乳酸菌發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物對(duì)·OH的清除能力(見圖1)。

圖1 乳酸菌對(duì)·OH的清除能力

由圖1知，乳酸菌LS85發(fā)酵上清液對(duì)·OH的清除能力最強(qiáng)，而乳酸菌S21－4胞內(nèi)提取物對(duì)·OH的清除能力最強(qiáng)。除C21－5和C21－7外，其余菌株發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物對(duì)·OH清除能力的差異不明顯。

2013年，水文局認(rèn)真學(xué)習(xí)貫徹黨的十八大及十八屆三中全會(huì)精神，扎實(shí)開展黨的群眾路線教育實(shí)踐活動(dòng)，緊密圍繞水利中心工作，積極踐行“大水文”發(fā)展理念，切實(shí)推進(jìn)水文行業(yè)管理和各項(xiàng)業(yè)務(wù)工作，特別是在做好服務(wù)防汛抗旱減災(zāi)和水資源管理等方面取得了一些成效，主要包括以下幾個(gè)方面：

選取LS85和S21－4進(jìn)行了DPPH·清除率的測(cè)定，結(jié)果見圖2。

圖2 乳酸菌對(duì)DPPH·的清除能力

由圖2可知，LS85發(fā)酵上清液對(duì)DPPH·清除率明顯高于S21－4，二者的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)DPPH·清除率無(wú)明顯差異。綜合考慮其抗氧化的能力，最后選擇LS85菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究。

2.3 抗氧化乳酸菌菌株LS85的生物學(xué)特性

2.3.1 菌株LS85的生長(zhǎng)曲線

乳酸菌LS85培養(yǎng)72 h的生長(zhǎng)曲線和pH值變化情況見圖3。由圖3可知，乳酸菌LS85在0～2 h為遲緩期，從第2 h起進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，在第32 h時(shí)菌體密度達(dá)到最大值，此后菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，其培養(yǎng)液pH值在24 h內(nèi)由pH6.58降至pH3.88，以后進(jìn)入動(dòng)態(tài)平衡。

圖3 乳酸菌LS85培養(yǎng)72h的生長(zhǎng)曲線和pH值變化

圖4 乳酸菌LS85在不同溫度下的生長(zhǎng)情況

2.3.2 菌株LS85在不同溫度下的生長(zhǎng)情況

菌株LS85在不同溫度下的生長(zhǎng)情況見圖4。由圖4知，該菌能在15～40℃內(nèi)生長(zhǎng)，只是在15℃和20℃時(shí)，生長(zhǎng)緩慢，而在 25、30、35、40℃ 下生長(zhǎng)速度較快，差異不明顯。具有較寬的生長(zhǎng)溫度范圍。

2.3.3 菌株間的拮抗試驗(yàn)

乳酸菌LS85與木糖葡萄球菌S02的拮抗試驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖5可知，LS85+S02組可以共同生長(zhǎng)，相互間沒(méi)有影響，即無(wú)拮抗作用。

圖5 乳酸菌LS85和葡萄球菌S02在模擬肉湯中混合培養(yǎng)時(shí)的相互關(guān)系

2.3.4 菌株LS85活菌液的急性毒性試驗(yàn)

以小白鼠為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)乳酸菌LS85的活菌液進(jìn)行的急性毒性試驗(yàn)表明，在15 d飼喂期內(nèi)，試驗(yàn)組和對(duì)照組小白鼠生長(zhǎng)良好，進(jìn)食正常，未見中毒死亡，解剖未見異常。雌、雄小鼠經(jīng)口LD50均大于15 000 mg/kgBW。根據(jù)GB15193.3－1994《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法》中急性毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，乳酸菌LS85的活菌液屬于實(shí)際無(wú)毒。

2.4 乳酸菌LS85的系統(tǒng)鑒定

2.4.1 乳酸菌LS85的形態(tài)學(xué)特征

乳酸菌LS85在MRS平板上的菌落特征:直徑約1.5 mm、圓形、凸起度中等、邊緣整齊、表面光滑、乳白色、不透明。革蘭氏染色鏡檢觀察為G+桿菌，短鏈或成排排列，大小為(1.1～1.2)μm×(2.0～2.3)μm，無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛，無(wú)莢膜。

2.4.2 乳酸菌LS85的生化鑒定

乳酸菌LS85的生化鑒定結(jié)果見表1。由于其接觸酶陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，不產(chǎn) H2S，15℃能生長(zhǎng)，確定為乳桿菌屬(Lactobacillus)。結(jié)合形態(tài)學(xué)指標(biāo)，由表1可知，對(duì)照文獻(xiàn)［18］，初步將菌株鑒定為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus LS85)。

表1 乳桿菌LS85的生化鑒定結(jié)果

2.4.3 乳酸菌LS85的分子遺傳學(xué)鑒定

以乳酸菌LS85的總DNA為模板，采用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到一條長(zhǎng)度約1.5kb的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。并將PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序片斷長(zhǎng)1450bp，具有典型的16S rDNA的特征。該序列在GenBank上的登陸號(hào)為EU693522。經(jīng)http://www.ncbi.nlm.nlh.gov網(wǎng)站中使用 BLASTN 2.2.15在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，比對(duì)結(jié)果表明乳酸菌LS85與登錄號(hào)EU483102.1、EU483101.1、AB362758.1 等10株戊糖乳桿菌的同源性為100%。結(jié)合形態(tài)、生化鑒定及16S rDNA比對(duì)結(jié)果表明乳酸菌LS85為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosusLS85)。

3 討論

3.1 肉品發(fā)酵劑乳酸菌的篩選

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)肉品發(fā)酵劑乳酸菌篩選的報(bào)道很多，但多為直接將已知菌種按照篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。從傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中分離乳酸菌菌株，再按照肉品發(fā)酵劑篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選與鑒定的報(bào)道較少。Papamanoli［6］、Fontana［7］、Aymerich［3］、Drosinos［22］從發(fā)酵香腸中分離出清酒乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、干酪乳桿菌(L.pentosus)、彎曲乳桿菌(L.pentosus)、植物乳桿菌(L.pentosus)、戊糖乳桿菌(L.pentosus)等優(yōu)勢(shì)乳酸菌。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者［8－12］從自然發(fā)酵肉制品中分離鑒定出清酒乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌(L.pentosus)、干酪乳桿菌、食品乳桿菌(L.pentosus)等［8－12］，適宜作肉品發(fā)酵劑。本文從四川傳統(tǒng)腌臘肉制品中的58株乳酸菌初步篩選出8株適宜為肉品發(fā)酵劑菌株，再以清除·OH和DPPH·的能力復(fù)篩，得到1株具有抗氧化能力的戊糖乳桿菌。該菌株生長(zhǎng)溫度范圍較廣，對(duì)木糖葡萄球菌沒(méi)有拮抗作用，小鼠急性毒性試驗(yàn)表明其為實(shí)際無(wú)毒，可用于功能性肉品發(fā)酵劑的開發(fā)。

3.2 乳酸菌的抗氧化能力

目前國(guó)外對(duì)乳酸菌抗氧化能力的研究較多。如Lee等［13］報(bào)道了干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)具有螯合金屬離子效應(yīng)、Lin等［16］報(bào)道了嗜酸乳桿菌(L.acidophfilus)和長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化和消除·OH的能力。而國(guó)內(nèi)張江巍等分別探討了乳酸菌［19］和發(fā)酵乳［15］抗氧化能力;張鳳敏等［23］篩選到具有抗氧化能力的植物乳桿菌;張書文等［24］研究了2株乳酸菌對(duì)活性氧的耐受性。本試驗(yàn)對(duì)8株乳酸菌消除·OH能力的結(jié)果表明所有的乳酸菌都具有一定的抗氧化能力，與文獻(xiàn)［19］報(bào)道的結(jié)果相一致，最終篩選到1株具有較強(qiáng)抗氧化能力的戊糖乳桿菌(L.pentosus)。其發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物對(duì)·OH的清除率分別為88.67%和75.6%;對(duì)DPPH·的清除率分別為46.3%和28.6%。目前具有抗氧化能力的乳酸菌主要有:嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、清酒乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、長(zhǎng)雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌等［13－16］，但還沒(méi)有關(guān)于從傳統(tǒng)肉制品中篩選到具有較強(qiáng)抗氧化能力的戊糖乳桿菌的報(bào)道，這對(duì)功能性肉品發(fā)酵劑的研發(fā)具有重要的理論意義與應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本文通過(guò)待測(cè)乳酸菌的耐鹽、耐亞硝酸鹽、接觸酶、氨基酸脫羧酶、硝酸鹽還原酶、產(chǎn)氨、產(chǎn)H2S、產(chǎn)氣和產(chǎn)粘液試驗(yàn)等指標(biāo)符合肉品發(fā)酵劑標(biāo)準(zhǔn)后，再以對(duì)·OH、DPPH·清除率為抗氧化指標(biāo)，并對(duì)篩得的菌株進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)和細(xì)菌學(xué)系統(tǒng)鑒定，獲得了1株安全而有抗氧化性能的肉品發(fā)酵劑戊糖乳桿菌。研究結(jié)果對(duì)于改進(jìn)發(fā)酵肉制品的品質(zhì)和安全性具有重要意義。

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