聶曉東, 許泓瑜, 陸震鳴, 許正宏 ＊

(1.江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

雞樅菌菌絲體皂甙含量測(cè)定方法的研究

聶曉東1,2, 許泓瑜1, 陸震鳴2, 許正宏＊1

(1.江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

采用分光光度法測(cè)定雞樅菌發(fā)酵菌絲體中皂甙含量。以人參皂甙Rg1為對(duì)照品,在吸收波長(zhǎng)為550 nm下,標(biāo)準(zhǔn)濃度在10～240μg范圍內(nèi),濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為:Y=0.003 0X-0.0405,R2=0.998 4。加樣平均回收率為 99.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.97%,精密度的RSD為1.89%,雞樅菌絲體皂甙類含量為2.69 m g/g菌絲體。方法操作簡(jiǎn)單快速,靈敏度高且比較準(zhǔn)確。

雞樅菌;菌絲體;皂甙;測(cè)定

雞 樅 菌 (Termitomycesalbuminosus(Berkeley&Broome)Heim)是與白蟻共生的真菌[1],主要分布于非洲熱帶、亞洲熱帶、南太平洋島嶼和亞洲的亞熱帶地區(qū)[2]。雞樅菌肉質(zhì)細(xì)嫩,氣味濃香,味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明,雞樅菌有增強(qiáng)人體免疫功能、預(yù)防腸癌、養(yǎng)血潤(rùn)燥健脾胃等功效,適用于食欲不振、虛勞怔忡、痔瘡下血者等[3],為古今中外頗受贊美的名貴食用菌,對(duì)其雞樅發(fā)酵產(chǎn)品做詳細(xì)的研究[4],為近年所關(guān)注。

皂甙是雞樅菌中的主要活性成分,是極具潛力的天然產(chǎn)物資源之一,受到人們廣泛的關(guān)注。目前,常用正丁醇來(lái)萃取中藥材和植物中的總皂甙,然后采用香草醛-高氯酸比色法來(lái)測(cè)定其含量,該法具有靈敏性高,穩(wěn)定性好的特點(diǎn)[5]。但是由于該法在香草醛-高氯酸顯色前需要將沸點(diǎn)較高的溶劑正丁醇加熱揮發(fā)干,需要較長(zhǎng)時(shí)間,而且長(zhǎng)時(shí)間在高溫下烘干可能引起皂甙的結(jié)構(gòu)變化,從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文在原有香草醛-高氯酸法的基礎(chǔ)上改進(jìn)條件,采用無(wú)水硫酸鎂吸去正丁醇溶液中含有的水份,以避免水對(duì)顯色反應(yīng)的影響,然后對(duì)皂甙的正丁醇溶液直接用香草醛-高氯酸法測(cè)定皂甙含量。本實(shí)驗(yàn)為研究發(fā)酵過(guò)程中雞樅皂甙的變化規(guī)律提供了簡(jiǎn)便快速的測(cè)定方法,為雞樅的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)和科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參皂甙 Rg1:中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品,≥97.7%)。高氯酸、冰醋酸、香草醛等均為分析純。DK-8K型電熱恒溫水槽:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;UV-2100紫外可見(jiàn)光光度計(jì):UN ICO;數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品。

1.2 菌株與培養(yǎng)方法

雞樅菌菌種(JNPF-TA 01):保藏于江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室;

種子培養(yǎng)基:葡萄糖2 g/dL、酵母粉0.2 g/dL、硫酸鎂0.075 g/dL、磷酸二氫鉀0.15 g/dL,p H值用檸檬酸調(diào)為4.5。500 m L搖瓶裝液量為100 m L培養(yǎng)基,在150 r/min,28℃條件下培養(yǎng)3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖3 g/dL、酵母粉0.2 g/dL、硫酸鎂0.1 g/dL、磷酸二氫鉀0.2 g/dL,p H值用檸檬酸調(diào)為4.5。接種體積分?jǐn)?shù)為5%,500 m L搖瓶裝液量為100 m L培養(yǎng)基,在150 r/min,28℃條件下培養(yǎng)8 d。發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中菌絲體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.1%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 比色條件的選擇

1)最大吸收波長(zhǎng)的確定 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的人參皂甙Rg1標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg于100 m L的容量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度,即配制為質(zhì)量濃度0.2 mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

取人參皂甙Rg1標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4 mL于10 m L具塞磨口試管中,水浴加熱蒸干,加0.4 mL用硫酸鎂干燥后的正丁醇,加新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)為5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 m L和高氯酸0.8 m L,搖勻,60℃水浴加熱15 min,取出后立即用冰水冷卻,加入5 mL冰醋酸稀釋,搖勻,在400～700 nm處掃描,確定最大吸收波長(zhǎng)。

圖1 顯色體系的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of color system

將顯色溶液在400～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,如圖1所示,在550 nm處有最大吸收峰,所以選用此波長(zhǎng)為比色分析的波長(zhǎng)。

2)香草醛用量的選擇 取人參皂甙Rg1標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4 m L于10 mL具塞磨口試管中,水浴加熱蒸干,加0.4 m L用硫酸鎂干燥后的正丁醇,加不同體積新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸0.8 m L,搖勻,60℃水浴加熱15 min,取出后立即用冰水冷卻,加入5 mL冰醋酸稀釋,搖勻,在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

如圖2所示,當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為5%香草醛-冰醋酸溶液用量達(dá)到0.2 mL后,反應(yīng)的吸光度變化很小,所以選用0.2 m L體積分?jǐn)?shù)5%香草醛冰醋酸溶液用量為香草醛-冰醋酸溶液的最適用量。

3)高氯酸用量的選擇 取人參皂甙Rg1標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4 m L于10 mL具塞磨口試管中,水浴加熱蒸干,加0.4 m L用硫酸鎂干燥后的正丁醇,加新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 m L和不同體積的高氯酸,搖勻,60℃水浴加熱15 m in,取出后立即用冰水冷卻,加入5 m L冰醋酸稀釋,搖勻,在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

圖2 體積分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液用量對(duì)顯色反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of 5%van illin-acetic acid dosage on the color reaction

圖3 高氯酸用量對(duì)顯色反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of perchloric acid dosage on the color reaction

如圖3所示,當(dāng)高氯酸用量大于0.8 m L時(shí),反應(yīng)的吸光度變化很小,所以選用0.8 mL高氯酸用量為高氯酸的最適用量。

4)顯色溫度的選擇 取人參皂甙Rg1標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4 m L于10 mL具塞磨口試管中,水浴加熱蒸干,加0.4 m L用硫酸鎂干燥后的正丁醇,加新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 m L和高氯酸0.8 m L,搖勻,不同溫度下水浴加熱15 min,取出后立即用冰水冷卻,加入5 m L冰醋酸稀釋,搖勻,在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

圖4 顯色溫度對(duì)顯色反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of color temperature on the color reaction

如圖4所示,反應(yīng)的吸光度隨著溫度的提高而增加,當(dāng)溫度超過(guò)60℃后,反應(yīng)的吸光度下降很小,所以選用60℃為反應(yīng)的最適溫度。

5)顯色時(shí)間的選擇 取人參皂甙Rg1標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4 mL于10 m L具塞磨口試管中,水浴加熱蒸干,加0.4 m L用硫酸鎂干燥后的正丁醇,加新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 m L和高氯酸0.8 m L,搖勻,60℃水浴加熱不同時(shí)間,取出后立即用冰水冷卻,加入5 mL冰醋酸稀釋,搖勻,在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

圖5 顯色時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of color time on the color reaction

如圖5所示,反應(yīng)的吸光度隨著時(shí)間的增加而增加,當(dāng)時(shí)間超過(guò)15 min后,反應(yīng)的吸光度增加減慢,所以選用15 min為反應(yīng)的最適時(shí)間。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 依次精確吸取人參皂甙Rg1標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 、1.20 mL 至 10 m L 的具塞試管中,加熱揮盡溶劑,加0.4 mL用硫酸鎂干燥后的正丁醇,按前述方法顯色,550 nm處測(cè)定吸光度,并以人參皂甙 Rg1質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),。以試劑空白為參比液,繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍。

1.3.3 測(cè)定方法的評(píng)價(jià)

1)測(cè)定方法的穩(wěn)定性 取人參皂甙Rg1標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4 m L于10 mL具塞磨口試管中,水浴蒸干,加0.4 m L用硫酸鎂干燥后的正丁醇,加入體積分?jǐn)?shù)5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,加入高氯酸0.8 mL,搖勻,60℃恒溫水浴加熱15 min,取出后立即冷卻,加入5 mL冰醋酸稀釋,同時(shí)做空白,在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度在不同時(shí)間的變化。

2)測(cè)定方法的精密度 采用Lu的方法提取雞樅菌絲體皂甙類化合物[6]。分別準(zhǔn)確稱取6份烘至恒重的雞樅菌絲體0.6 g,加10 m L水80℃浸提2 h,過(guò)濾,濾液用5 m L石油醚萃取2次。棄去石油醚相,水相用5 m L水飽和正丁醇萃取兩次,合并正丁醇相,用無(wú)水硫酸鎂干燥至無(wú)水,定容至10 m L。取樣品溶液0.4 mL于10 m L具塞磨口試管中,按前述方法顯色并測(cè)定吸光度,同時(shí)做空白,在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

3)加樣回收率 將樣品準(zhǔn)確測(cè)定后,加入已知量人參皂甙Rg1標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測(cè)定,以實(shí)際測(cè)得的樣品中皂苷含量的增加量除以加標(biāo)量即為加標(biāo)回收率。

1.3.4 雞樅快速測(cè)定方法與原來(lái)測(cè)定方法的比較

采用Lu的方法提取雞樅菌絲體皂甙類化合物[6]。取0.6 g烘至恒重的雞樅菌絲體,加10 m L水80℃浸提2 h,過(guò)濾,濾液用5 m L石油醚萃取2次。棄去石油醚相,水相用5 mL水飽和正丁醇萃取兩次,合并正丁醇相,用無(wú)水硫酸鎂干燥至無(wú)水,定容至10 m L。取樣品溶液0.4 m L于10 mL具塞磨口試管中,按前述方法顯色并測(cè)定吸光度,計(jì)算皂甙的含量。另外,按照傳統(tǒng)的香草醛-高氯酸法測(cè)定吸光度,計(jì)算皂甙的含量,比較兩種方法測(cè)定的結(jié)果。

1.3.5 雞樅菌絲體和子實(shí)體中總皂甙的提取和含量的分析 采用Lu的方法分別提取雞樅菌絲體和子實(shí)體的皂甙類化合物[6]。分別取0.6 g烘至恒重的雞樅菌絲體和雞樅子實(shí)體,加10 mL水80℃浸提2 h,過(guò)濾,濾液用5 m L石油醚萃取2次。棄去石油醚相,水相用5 m L水飽和正丁醇萃取兩次,合并正丁醇相,用無(wú)水硫酸鎂干燥至無(wú)水,定容至10 mL。取樣品溶液0.4 m L于10 m L具塞磨口試管中,按前述方法顯色并測(cè)定吸光度,計(jì)算皂甙的含量。

圖6 人參皂甙的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of the sapon in

如圖6所示,以人參皂甙Rg1的微克數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為:Y=0.003 0X-0.040 5,其中:X為質(zhì)量(μg),Y為吸光度,R2=0.998 4。說(shuō)明在10～240μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定方法的評(píng)價(jià)

2.1.1 測(cè)定方法的穩(wěn)定性 圖7為人參皂甙標(biāo)樣經(jīng)顯色反應(yīng)后反應(yīng)溶液的吸光值隨時(shí)間變化曲線。從圖中看出,顯色反應(yīng)后20 m in內(nèi)反應(yīng)溶液的吸光度變化很小,而20 min以后則溶液吸光度緩慢下降,所以吸光度測(cè)定應(yīng)該在顯色后20 min內(nèi)進(jìn)行。

圖7 顯色反應(yīng)的穩(wěn)定性Fig.7 The stability of color reaction

2.1.2 測(cè)定方法的精密度 測(cè)定方法的精密度如表1所示,6次實(shí)驗(yàn)所得樣品的平均吸光度為0.155,RSD=1.89%,說(shuō)明該測(cè)定方法具有較好的精密度。

表1 測(cè)定方法的精密度Tab.1 Determ ination of precision

2.1.3 加樣回收率 不同加樣量的加樣回收率測(cè)定結(jié)果如表2所示。6次加樣回收率實(shí)驗(yàn)的回收率在97.6%～102.2%范圍內(nèi),加樣回收率的平均值為99.4%,RSD=1.97%,表明加樣回收率符合要求,該測(cè)定方法的準(zhǔn)確度較高。

表2 測(cè)定方法的回收率Tab.2 Determination of recovery

續(xù)表2

2.1.4 雞樅皂甙測(cè)定方法比較 本實(shí)驗(yàn)將優(yōu)化后的皂甙測(cè)定方法與傳統(tǒng)的香草醛-高氯酸顯色法進(jìn)行比較,結(jié)果如表3所示。與香草醛-高氯酸顯色法相比,本實(shí)驗(yàn)的皂甙快速測(cè)定方法測(cè)得的的皂甙含量略低,但是相差不明顯?？紤]到本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的皂甙測(cè)定方法不需要將正丁醇加熱揮發(fā)干,所用時(shí)間大大減少,因此皂甙快速測(cè)定方法可以替代傳統(tǒng)香草醛-高氯酸顯色法進(jìn)行雞樅皂甙類化合物的測(cè)定。

表3 雞樅菌皂甙快速測(cè)定方法與香草醛-高氯酸顯色法測(cè)定皂甙含量的比較Tab.3 Determination of saponin content in comparison between rapid determination and vanillin-perchloric acid method

2.1.5 雞樅菌菌絲體和子實(shí)體中皂甙含量的分析

本實(shí)驗(yàn)將優(yōu)化后的皂甙測(cè)定方法用于測(cè)定雞樅菌菌絲體皂甙類化合物的含量,并與雞樅子實(shí)體皂甙含量進(jìn)行比較,比較結(jié)果如表4所示。雞樅菌菌絲體中皂甙類化合物的含量為2.69 mg/g菌絲體,RSD=2.91%;雞樅菌子實(shí)體中皂甙類化合物的含量為5.56 mg/g菌絲體,RSD=1.66%。由此可見(jiàn),雞樅菌菌絲體的皂甙含量要低于雞樅子實(shí)體,這可能是由于皂甙類化合物為真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物,而雞樅菌菌絲體深層培養(yǎng)的時(shí)間較短(8 d),皂甙類化合物尚未大量形成所致。

3 結(jié) 語(yǔ)

皂甙含量測(cè)定的方法主要有重量法、比色法、薄層層析法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)[7-10]。重量法主要利用皂甙在某些試劑中的最大溶解性或不溶性,而采取萃取或沉淀的方法來(lái)制取樣品。其缺點(diǎn)是操作過(guò)程較長(zhǎng),誤差較大不夠精確,同時(shí)在溶液的轉(zhuǎn)移和沉淀的轉(zhuǎn)移上都容易損失。薄層層析法和高效液相色譜法一般是以人參皂甙Rb1等極少數(shù)幾種物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn),相應(yīng)地測(cè)定原料或產(chǎn)品中某幾種皂甙含量,而無(wú)法測(cè)定總皂甙含量。目前香草醛-高氯酸比色法被認(rèn)為是較方便、準(zhǔn)確測(cè)定總皂甙含量的方法,適用于少量樣品的測(cè)定。常規(guī)的香草醛-高氯酸比色法需要在皂甙溶液和顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)前將待測(cè)皂甙溶液中的水分和沸點(diǎn)較高的正丁醇加熱揮發(fā)干,其目的是為了避免用于萃取總皂甙的水飽和正丁醇溶液中含有的微量水分對(duì)于顯色反應(yīng)所產(chǎn)生的較大影響。但是該法在樣品溶劑揮發(fā)時(shí)需要較長(zhǎng)時(shí)間,而且長(zhǎng)時(shí)間在高溫下?lián)]發(fā)可能引起皂甙的結(jié)構(gòu)變化,從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此本實(shí)驗(yàn)考慮采用無(wú)水硫酸鎂吸去正丁醇溶液中含有的水份,以避免水對(duì)顯色反應(yīng)的較大影響,進(jìn)一步研究在正丁醇溶液中進(jìn)行香草醛-高氯酸法反應(yīng)的各種反應(yīng)條件。本方法為研究雞樅菌絲體發(fā)酵過(guò)程中總皂甙的變化規(guī)律提供了簡(jiǎn)便快速的測(cè)定方法。

本文在香草醛-高氯酸比色法的基礎(chǔ)上改進(jìn)條件,確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件為:依次加入待測(cè)試樣0.4 m L正丁醇溶液,新制的體積分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 m L及高氯酸0.8 m L,60℃水浴15 min,取出后立即用冰水冷卻,搖勻,在波長(zhǎng)為550 nm處測(cè)定雞樅菌絲體皂甙,加樣平均回收率為99.4%,其RSD為 1.97%,精密度的RSD為1.89%,雞樅菌絲體皂甙類含量為2.69 mg/g菌絲體。結(jié)果表明,結(jié)果穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,且操作簡(jiǎn)便快捷。

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Determination of Saponins from the Mycelia of Termitomyces albuminosus in Submerged Culture

NIE Xiao-dong1,2, XU Hong-yu1, LU Zhen-ming2, XU Zheng-hong＊1
(1.School of Medicine and Pharmaceutics,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.The Key Lab of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In this study,the spectropho tometric method was used for determining the content of saponins from the mycelia in submerged culture.Ginsenoside Rg1 as the standard,at 550 nm,the linear range of the saponins concentration was from 10μg to 240μg,and the regressive equation wasY=0.003 0X-0.040 5,R2=0.998 4.The recovery rate was 99.4%and the relative standard deviation(RSD)w as 1.97%.The relative standard deviation(RSD)of the accuracy was 1.89%.The content of saponins from the mycelia in submerged culture was about 2.69 mg/g.The method presented here has been proven to be convenient to operate and the result is accurate and highly sensitive.

Termitomyces albuminosus,mycelia,saponins,determination

Q 939.9

A

1673-1689(2010)02-0288-06

2008-09-17

國(guó)家863資助項(xiàng)目(2007AA 021506);國(guó)家973資助項(xiàng)目(2007CB707800);教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET20720380)。

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許正宏(1971-),男,江蘇姜堰人,工學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事生物制藥方面的研究。Email:zhenghxu@163.com

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