王成武，李 嫻，楊 玲，客 涵，張志山，楊德光，張延華

山東省淡水水產(chǎn)研究所，山東 濟南 250117

張懷菊 (齊魯動物保健品廠， 山東 濟南 250100)

付佩勝 (山東省淡水水產(chǎn)研究所，山東 濟南 250117)

4個羅非魚群體遺傳多樣性的RAPD分析

王成武，李 嫻，楊 玲，客 涵，張志山，楊德光，張延華

山東省淡水水產(chǎn)研究所，山東 濟南 250117

張懷菊 (齊魯動物保健品廠， 山東 濟南 250100)

付佩勝 (山東省淡水水產(chǎn)研究所，山東 濟南 250117)

采用50個隨機引物對奧利亞羅非魚 (Oreochromisaureus)和3個尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)群體即無錫品系、埃及品系和吉富品系進行RAPD分析，共篩選出13個重復性好的引物，其中引物S1255擴增的2 500 bp片段具有群體特異性，可作為區(qū)分奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚的分子標記；用PopGen1.32軟件進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明：奧利亞羅非魚、無錫品系、埃及品系和吉富品系羅非魚群體內(nèi)的多態(tài)位點率分別為22.03%、52.54%、58.47%、62.71%,基因多樣性指數(shù)分別為0.091 2、0.216 6、0.244 8、0.270 5,Shannon信息指數(shù)分別為0.132 3、0.313 6、0.353 7、0.388 1。無錫品系、埃及品系和吉富品系羅非魚群體內(nèi)遺傳相似性指數(shù)分別為0.819 4、0.788 6和0.770 4，遺傳變異水平較高，遺傳多樣性豐富。奧利亞羅非魚的群體內(nèi)遺傳相似性指數(shù)為0.927 9，群體的遺傳純度高，遺傳變異水平較低。無錫、埃及、吉富品系尼羅羅非魚與奧利亞羅非魚之間的遺傳距離分別為0.137 0、0.223 5，0.198 6,說明奧利亞羅非魚和埃及品系尼羅羅非魚雜交可能產(chǎn)生更強的雜種優(yōu)勢。

奧利亞羅非魚(Oreochromisaureus) ；尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus) ；RAPD；分子標記；遺傳多樣性

RAPD技術(shù)是1990年由Williams[1]和Welsh[2]在PCR技術(shù)基礎上發(fā)展起來的一種分子標記技術(shù)。RAPD分析通常采用隨機合成的10個堿基的寡核苷酸引物，從基因組中隨機擴增多態(tài)性DNA片段，其基因標記可覆蓋整個基因組，短時間內(nèi)可獲得大量的遺傳標記，RAPD技術(shù)在親緣關系分析、種質(zhì)鑒定、種質(zhì)資源保護等方面[3～7]得到廣泛應用。

羅非魚屬鱸形目(Perciformes)麗魚科(Cichidae)羅非魚屬，為溫水性魚類，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向全球推廣的淡水經(jīng)濟魚類，因其具有生長速度快、繁殖力強、抗病力強、食性雜等優(yōu)點，養(yǎng)殖面積遍布多個國家和地區(qū)。羅非魚養(yǎng)殖在我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中占有非常重要的地位，我國羅非魚產(chǎn)量占世界羅非魚年產(chǎn)量的70%。但由于羅非魚存在性成熟早、繁殖周期短和容易發(fā)生種間雜交導致種質(zhì)退化和混雜等問題，嚴重影響了其養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。為更好地保護和利用羅非魚資源，筆者采用RAPD技術(shù)對奧利亞羅非魚(Oreochromisaureus)和3個品系(無錫、埃及、吉富)尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)群體進行檢測和遺傳分析，以揭示不同羅非魚群體的遺傳多樣性及種間遺傳差異，并了解其種質(zhì)現(xiàn)狀，為羅非魚良種培育和選育提供理論依據(jù)，并為分子標記輔助育種工作提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

試驗所用奧利亞羅非魚和3個品系尼羅羅非魚均取自山東省淡水水產(chǎn)研究所羅非魚原種場，每種各取5尾進行RAPD分析。其中奧利亞羅非魚(A)由山東省羅非魚原種場引自埃及；無錫品系(W)中國水科院淡水漁業(yè)研究中心1992年引自美國；埃及品系(E)山東省羅非魚原種場2000年引自埃及；吉富品系(G)由山東省淡水水產(chǎn)研究所羅非魚原種場引自海南。

試驗所用隨機引物均購自上海生工生物工程公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、Marker等試劑為大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)；PCR儀為Takara TP650型。

1.2 方法

(1) 總DNA提取 每尾魚取背部肌肉300 mg，充分剪碎后于研缽中加液氮研磨成粉末，加入2 mL細胞裂解液(Tris-Cl 50 mmol/L pH 8.0、EDTA 100 mmol/L pH 8.0、0.5% SDS )，加入終濃度0.1 mg/mL的蛋白酶K，充分混勻后放入37 ℃水浴中消化12 h。加入等體積 Tris飽和酚抽提2次，再加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提至無蛋白質(zhì)中間相，加入2倍體積的無水乙醇沉淀后，70%乙醇洗滌2次，加入TE(pH 8.0)充分溶解后置于-20 ℃保存。

(2) PCR擴增 PCR反應體系總體積為25 μL，其中：10 ×buffer 2.5 μL,dNTPS2 μL(各2.5 mmol/L),MgCl23 μL (25 mmol/L),隨機引物2.5 μL (2μmol/L),Taq DNA聚合酶0.25 μL( 5U/μL)，模板DNA 1 μL,以滅菌雙蒸水補齊。

PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min后進行45個循環(huán)：94 ℃變性 40 s ，36 ℃退火 50 s ，72 ℃延伸 90 s；最后于72 ℃延伸10 min。

取2 μL PCR產(chǎn)物,加入適量loading Buffer,在1.4%的瓊脂糖凝膠上按5 V/cm凝膠電壓下進行電泳分析，EB染色，置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

(3) RAPD引物篩選 以奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚DNA為模板，采用50個引物進行RAPD引物篩選，挑選出重復性好的帶型清晰的引物用于進一步試驗分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計在瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)的DNA片段，同一電泳凝膠上，遷移率相同的都視為同一位點，無論強度明亮與否，只要清晰可見的都采用，按出現(xiàn)的記為“1”，不出現(xiàn)的記為“0”，進行統(tǒng)計，將電泳圖轉(zhuǎn)化為0，1矩陣。把每一條帶看做一個等位基因，假設實驗群體處于Hardy-Weinberg平衡，用PopGen 1.32軟件計算各群體的多態(tài)位點率、Shannon信息指數(shù)和基因多樣性指數(shù),其計算方法分別為：

多態(tài)位點比例(P，%)=多態(tài)位點數(shù)/位點總數(shù)×100

個體間的遺傳相似系數(shù)參照Lynch[8]的公式計算

Sxy=2Nxy/(Nx+Ny)

式中,Nxy是個體x和y的共有條帶數(shù)；Nx和Ny分別是個體x和y的擴增條帶數(shù)。

群體內(nèi)的遺傳相似性系數(shù)(S)為群體內(nèi)所有兩個個體間相似系數(shù)的平均值。群體間的遺傳相似性指數(shù)(Sij)是群體i和群體j中的任意兩個個體隨機組合得到的相似系數(shù)的平均值，群體間的遺傳距離Dij用下式計算[9]：

式中,Si和Sj是種群i和j的群體內(nèi)遺傳相似指數(shù)。

基于遺傳距離D，采用UPGMA(Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Average)方法對4個羅非魚群體進行聚類分析。

Shannon信息指數(shù)I=-∑XilnXi(Xi為位群體中位點i的顯性頻率)

基因多樣性指數(shù)H=1-∑Pi2(Pi為群體中位點i的顯性頻率)

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增

從本研究所用的50個引物中進行篩選，共篩選出重復性好的引物13個：S1038、S1255、S2016、S509、S1104、S419、S1024、S1199、S448、S307、S1307、S1064、S1305。13個引物都產(chǎn)生了具有個體或群體特異性的條帶，共擴增出118條帶，平均每個引物擴增出9條帶，擴增出的片段分子量在300～3 000 bp之間，篩選出的引物名稱和序列見表1。

表1 隨機引物編號及其序列Table 1 Random primers and their sequences

2.2 4個羅非魚群體的遺傳多樣性

經(jīng)PopGen 1.32軟件計算，奧利亞羅非魚、無錫品系、埃及品系、吉富品系尼羅羅非魚的多態(tài)位點數(shù)分別為26、62、69、74，多態(tài)位點率分別為22.03%、52.54%、58.47%、62.71%，基因多樣性指數(shù)分別為0.091 2、0.216 6、0.244 8、0.270 5，Shannon信息指數(shù)分別為0.132 3、0.313 6、0.353 7、0.388 1。與奧利亞羅非魚相比，3個尼羅羅非魚群體的遺傳多樣性均較豐富，其中吉富品系在3個品系尼羅羅非魚中遺傳多樣性最為豐富。

2.3 4個羅非魚群體的遺傳相似度和遺傳距離

表2 4個羅非魚群體的群體內(nèi)和群體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離Table 2 Intra-and interpopulation genetic similarity coefficients andinterpopulation genetic distances in four tilapia populations

注：數(shù)字矩陣對角線以上數(shù)字為群體間遺傳相似系數(shù)，對角線以下為群體間的遺傳距離,對角線上數(shù)字為群體內(nèi)遺傳相似系數(shù)。

依據(jù)13個引物的擴增結(jié)果計算出奧利亞羅非魚、無錫品系尼羅羅非魚、埃及品系尼羅羅非魚和吉富品系羅非魚群體內(nèi)和群體間的遺傳相似度和遺傳距離(表2)。結(jié)果顯示，4個羅非魚群體的群體內(nèi)遺傳相似系數(shù)為：A(0.927 9)、W (0.819 4)、E (0.788 6)、G (0.770 4)；其中奧利亞羅非魚的群體內(nèi)相似系數(shù)最大，說明其群體內(nèi)的遺傳變異性很小，而3個品系尼羅羅非魚群體內(nèi)的遺傳相似系數(shù)較小，說明其群體內(nèi)的遺傳變異程度較大。4個羅非魚群體的群體間遺傳相似系數(shù)在0.684 1～0.741 8之間，其中無錫品系和埃及品系的遺傳相似系數(shù)最大，為0.741 8(D=0.080 3)，埃及品系和奧利亞羅非魚群體間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.684 1(D=0.223 5)。無錫品系、埃及品系和吉富羅非魚群體與奧利亞羅非魚群體間的遺傳距離分別為0.137 0、0.223 5和0.198 6(表2)。

2.4 種間特異性標記

采用引物S1255進行擴增，結(jié)果顯示，奧利亞羅非魚在2 500 bp處有一特異擴增性片段，在其他3個尼羅羅非魚群體中均未出現(xiàn)(圖1)，且該片段具有很好的重復性，可作為區(qū)分奧利亞羅非魚與其他3個品系羅非魚的分子標記。

1～5: G ； 6～10: E ； 11～15: W ； 16～20: A ； M：DNA Marker Ⅲ。箭頭所指為特異帶。圖1 引物S1255對4個羅非魚群體的擴增結(jié)果Figure 1 The RAPD results amplified by primer S1255

圖2 用類平均聚類法構(gòu)建的4個羅非魚群體的聚類圖Figure 2 UPGMA dendrogram on the basis of genetic distance

2.5 聚類分析

根據(jù)遺傳距離,用MEGA4軟件的

UPGMA程序?qū)?個羅非魚群體進行聚類分析，其結(jié)果見圖2。由圖2可見，無錫品系和埃及品系尼羅羅非魚首先聚在一起，其次是吉富品系羅非魚，最后是奧利亞羅非魚。

3 討論

3.1 羅非魚的分子標記

很多學者對羅非魚的分子遺傳標記方面進行了研究，曹螢等[10]利用mtDNA酶切技術(shù)發(fā)現(xiàn)PvuⅡ酶在奧利亞和尼羅羅非魚上酶切結(jié)果不同，可作為區(qū)分2種羅非魚的分子標記；王文君[11]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶ApaⅠ可區(qū)分奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚；夏德全[6]研究發(fā)現(xiàn)4個引物的擴增片段可作為鑒別奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚的分子標記，但未找到鑒別3個尼羅羅非魚群體的分子標記；杜誠等[5]對5個羅非魚群體進行的遺傳分析和分子標記研究中發(fā)現(xiàn)引物S509擴增的片段可作為區(qū)分奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚的分子標記，同時還發(fā)現(xiàn)AnⅠ、AnⅡ、GF區(qū)分AnⅢ的分子標記，AnⅡ區(qū)分AnⅠ、GF的分子標記；趙金良等[12]研究發(fā)現(xiàn)Est-2譜帶為埃及品系和吉富品系羅非魚特有，可作為與其他品系尼羅羅非魚區(qū)分的生化遺傳標志。

本研究中發(fā)現(xiàn)引物S1255在2 500 bp的擴增片段為奧利亞羅非魚所特有，而在其他3個尼羅羅非魚群體中均未出現(xiàn)，可作為區(qū)分奧利亞羅非魚與其他3個尼羅羅非魚群體的分子標記,由于3個尼羅羅非魚群體間的遺傳相似系數(shù)較高(群體間遺傳相似度為0.693 8 ～ 0.741 8)，未找到有效鑒別它們的分子標記。

3.2 4個羅非魚群體的遺傳多樣性

本研究通過RAPD方法分析了4個羅非魚群體的遺傳多樣性和遺傳變異水平。其中奧利亞羅非魚的多態(tài)位點率、基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)分別為22.03%、0.091 2和0.132 3，其群內(nèi)遺傳相似指數(shù)高達0.927 9，說明奧利亞羅非魚群體的遺傳變異較小，這與夏德全[6]、杜誠[5]和董在杰等[13]的研究結(jié)果相似。造成這種結(jié)果主要是因為奧利亞品質(zhì)羅非魚群體在引進時經(jīng)歷了遺傳瓶頸效應影響，并且由于奠基群小，在純種繁殖時存在群體內(nèi)的近交，從而形成高遺傳純度的群體。高遺傳純度使通過家系選育提高奧利亞羅非魚的性能很難進行。可見在今后奧利亞羅非魚的育種工作中，應防止近交衰退，在確保選育親本數(shù)量的同時還應加強對選育群體遺傳多樣性的檢測，在保持優(yōu)良性狀穩(wěn)定性的同時，最大限度地保留其遺傳多樣性水平。

吉富品系羅非魚是國際水生生物資源管理中心利用4個亞洲尼羅羅非魚品系(以色列、新加坡、泰國、中國臺灣)與4個非洲尼羅羅非魚品系(埃及、加納、肯尼迪、塞內(nèi)加爾)進行種內(nèi)雜交選育而成的，其遺傳背景復雜，雜種優(yōu)勢相當明顯，生長速度快。本研究結(jié)果表明，與奧利亞羅非魚相比，3個尼羅羅非魚群體都具有較高的遺傳多樣性水平，遺傳變異較大，其中吉富品系羅非魚遺傳多樣性水平最高，遺傳純度低。

為解決羅非魚性成熟早導致的過度繁殖影響?zhàn)B成的現(xiàn)象,目前生產(chǎn)中主要采用奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚雜交生產(chǎn)高雄性率的尼奧魚，同時充分利用其雜種優(yōu)勢達到提高羅非魚生長速度和產(chǎn)量的目的，王楚松等[14]研究報道，尼羅羅非魚魚奧利亞羅非魚的雜交子代雄性率可達95%。無錫品系、埃及品系和吉富品系尼羅羅非魚群體與奧利亞羅非魚群體間的遺傳距離分別為0.137 0、0.223 5、0.198 6，這一結(jié)果與其他學者[5，6，15，16]對奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚種間遺傳差異的研究結(jié)果基本相同，說明用RAPD技術(shù)對羅非魚的遺傳多樣性檢測可信度較高，其中埃及品系尼羅羅非魚與奧利亞羅非魚群體間的遺傳距離最大(0.223 5)。孫其信等[17]和Melchinger等[18]的研究表明，在遺傳距離小于0.54的范圍內(nèi)，親本間的遺傳距離越大，其雜交子代基因型雜合度越高，雜種優(yōu)勢越強；據(jù)此可以推斷，以奧利亞羅非魚和埃及品系尼羅羅非魚為親本進行雜交，其雜交子代的雜種優(yōu)勢會較強。鑒于吉富品系羅非魚的特殊遺傳背景所表現(xiàn)出的雜種優(yōu)勢，吉富與奧利亞雜交子代同樣也保持了生長速度上的優(yōu)勢。據(jù)報道，“吉奧”魚的養(yǎng)殖效果是3個尼羅與奧利亞羅非魚雜交組合中最好的，但雄性率稍低[19]。雜交子代雄性率的高低與親本的種質(zhì)純度有很大關系，親本的純度越高，雄性率越高，因此有效提高羅非魚親本純度是提高雄性率的關鍵。本研究中的3個尼羅羅非魚群體遺傳多樣性均很豐富，需不斷進行選育保持其遺傳純度以提供優(yōu)良的雜交后代。

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2008-08-19

山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目

王成武(1979-)，男，山東濟南人，農(nóng)學碩士，助理研究員，主要從事魚類遺傳育種研究.

付佩勝，E-mail:jnsfu@126.com.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.01.017

Q37;Q959.483

A

1673-1409(2009)01-S059-05