劉 華，姚 振 (長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

馬鈴薯莖段快繁及試管薯誘導(dǎo)

劉 華，姚 振 (長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

在馬鈴薯(Solanumtuberosum)的莖段快繁中，采用生根時(shí)間、生根率、節(jié)間長(zhǎng)度和粗度作為評(píng)估馬鈴薯莖段快繁壯苗的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，以MS為基本培養(yǎng)基，添加40 mg/L 的B9處理馬鈴薯莖段快繁效果最好；黑暗處理20 d，并在培養(yǎng)基中添加B9能夠提高試管薯誘導(dǎo)的效果。

馬鈴薯(Solanumtuberosum)；莖段快繁；試管薯

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)屬茄科茄屬植物，在生長(zhǎng)期間容易受病毒侵染，病毒一旦侵入，表現(xiàn)出各種各樣的退化類型。在生產(chǎn)中，主要是利用莖尖分生組織的脫毒培養(yǎng)，提高馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[1，2]。

馬鈴薯莖段快繁、培育壯苗和誘導(dǎo)試管薯是馬鈴薯脫毒生產(chǎn)的重要的環(huán)節(jié)，這些環(huán)節(jié)的研究對(duì)于優(yōu)化整個(gè)莖尖脫毒體系有重要的意義。有研究表明，B9和CCC對(duì)培育壯苗有作用[3～5]，此外，光照對(duì)誘導(dǎo)試管薯具有影響[6]。本研究采用脫毒苗的生根時(shí)間、生根率、節(jié)間長(zhǎng)度和粗度作為評(píng)估壯苗的標(biāo)準(zhǔn)，探討B(tài)9和CCC對(duì)莖段快繁和培育壯苗的影響，并研究采用2種不同的光照處理結(jié)合高濃度的B9來(lái)誘導(dǎo)試管薯的效果。

1 材料與方法

1.1 外植體的獲得和接種

選擇生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的馬鈴薯塊莖于沙盤(pán)中催芽，保持其濕潤(rùn)狀態(tài)，15 d后取芽作為外植體。將莖段置于75%的酒精中消毒30 s，再用0.1%的升汞消毒15 min，最后用無(wú)菌水清洗3 ～ 4次，解剖鏡下切取莖尖放入培養(yǎng)基MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA中培養(yǎng)。

1.2 愈傷組織的繼代培養(yǎng)和分化

將莖尖在28 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，約40 ～ 60 d可形成愈傷組織。此時(shí)所形成的愈傷組織較小，在培養(yǎng)基MS + 4.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA中進(jìn)行繼代培養(yǎng)并分化。

1.3 莖段快繁及壯苗培養(yǎng)

將分化的脫毒小苗切成小段，每段帶一個(gè)葉片，插入莖段快繁培養(yǎng)基，培養(yǎng)基分別添加B9和CCC，B9濃度為20、40、60 mg/L，CCC濃度為0.1、0.5、1.0 mg/L，以 MS培養(yǎng)基作為對(duì)照。每個(gè)處理至少60個(gè)莖段，記錄莖段在不同的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，包括生根時(shí)間、莖段恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)間、20 d后的生根率、莖節(jié)間的長(zhǎng)度和粗度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 試管薯的誘導(dǎo)

將培養(yǎng)的壯苗剪切成段，每段帶2 ～ 3個(gè)葉片，葉片向上插入添加含有不同B9濃度的MS培養(yǎng)基中，將所有的苗放在14 h光照10 h黑暗的光周期環(huán)境中處理一周，一周后進(jìn)行光照處理。B9為3個(gè)水平(200、350、500 mg/L)，光照處理為2個(gè)水平(光照14 h/黑暗10 h光周期培養(yǎng)，黑暗處理20 d后轉(zhuǎn)入光照14 h/黑暗10 h培養(yǎng))，每個(gè)處理至少120個(gè)莖段。觀察記錄試管薯誘導(dǎo)期間各個(gè)處理的試管薯誘導(dǎo)率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

培養(yǎng)基瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%，pH5.8，高壓滅菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖段快繁和壯苗培養(yǎng)

(1) 生根時(shí)間和恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)間 從圖1可以看出，馬鈴薯莖段在添加CCC時(shí)開(kāi)始生根時(shí)間較短，而添加B9的生根時(shí)間都較長(zhǎng)。在B9濃度為40 mg/L時(shí)其開(kāi)始生根時(shí)間最長(zhǎng)，平均為7.6 d。CCC的生根時(shí)間都較短，在CCC為0.5 mg/L的生根時(shí)間最長(zhǎng)，平均6.2 d，0.1 mg/L CCC和1.0 mg/L CCC時(shí)的開(kāi)始生根時(shí)間較短，分別為5.4和4.4 d。1.0 mg/L CCC在整個(gè)處理中其開(kāi)始生根時(shí)間最短。從莖段恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)間來(lái)看，各個(gè)處理的恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)間相差不大。

圖1 莖段在不同培養(yǎng)基下的生根時(shí)間和恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)間Figure 1 Time of rooting and recovery growth of shoot cuttings on different media

(2) 生根率 從表1可以看出，MS培養(yǎng)基添加40 mg/L B9以及1.0 mg/L CCC時(shí)的生根率最高，達(dá)到95%以上。B9濃度上升到60 mg/L時(shí)，生根率顯著下降，生根率為34.88%。生根率隨著CCC濃度的升高而升高。在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中的生根率為56.73%，不添加任何激素可以使莖段苗生根，只是所需要用的時(shí)間較長(zhǎng)。

在整個(gè)培育壯苗和莖段快繁中，生根時(shí)間較短的處理其生根率也最高，1.0 mg/L CCC的開(kāi)始生根時(shí)間平均為4.4 d，20 d的生根率為95.95%。

表1 不同的培養(yǎng)基對(duì)莖段的生根率和節(jié)間長(zhǎng)度與粗度的影響Table 1 The effect of different media on rooting frequency and coarseness and Length of internode for shoot cuttings

注：鄧肯氏顯著性檢驗(yàn)，不同大、小寫(xiě)字母分別表示在0.01、0.05水平上存在顯著性差異

(3) 試管苗節(jié)間長(zhǎng)度和粗度 對(duì)于脫毒苗的大規(guī)模生產(chǎn)需要選擇較粗壯的試管苗，節(jié)間越粗，苗越壯，越容易成活。當(dāng)培育的試管苗可以移栽的時(shí)候，測(cè)定試管苗第二節(jié)間的粗度和長(zhǎng)度。從表1可以看出，添加20 mg/L B9的節(jié)間粗度為0.095 9 cm，在所有處理中節(jié)間粗度最粗。隨著B(niǎo)9濃度的升高，節(jié)間粗度變小。添加0.1 mg/L CCC的節(jié)間粗度為0.073 6 cm，節(jié)間粗度隨著CCC濃度的升高而變小。從表1還可以看出，20 mg/L B9的節(jié)間長(zhǎng)度并不是最短的。此外，隨著CCC濃度的升高，節(jié)間長(zhǎng)度越長(zhǎng)，苗生長(zhǎng)狀況也不好。

添加1.0 mg/L CCC的開(kāi)始生根時(shí)間最短，生根率也較高，但是苗生長(zhǎng)情況不是最好，苗的節(jié)間長(zhǎng)，且苗較細(xì)弱，效果最好為添加0.5 mg/L 的CCC。從B9處理來(lái)看，B9為40 mg/L的生根率最高，但以20 mg/L B9的開(kāi)始生根的時(shí)間最短，苗也較粗壯。綜合來(lái)看，添加40 mg/L B9的效果最好。

2.2 試管薯的誘導(dǎo)

圖2 光照處理和B9濃度對(duì)結(jié)薯率的影響Figure 2 The effect of light treatment with concentration of B9 on frequency of tuberization

從圖2中可以看出，在相同的光照條件下隨著B(niǎo)9濃度的升高，結(jié)薯率下降，在光周期條件培養(yǎng)的200 mg/L B9的結(jié)薯率為48%，當(dāng)B9濃度達(dá)到500 mg/L時(shí)的結(jié)薯率為12%。在黑暗狀態(tài)下200 mg/L B9的結(jié)薯率為70%，比光照狀態(tài)下的結(jié)薯率高22%。黑暗狀態(tài)下的結(jié)薯率明顯高于光照狀態(tài)下的結(jié)薯率。因此黑暗狀態(tài)處理200 mg/L B9的誘導(dǎo)試管薯的效果最好。在不含任何激素的培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基中，也可以誘導(dǎo)試管薯只是所需要的時(shí)間較長(zhǎng)。在整個(gè)處理中，還沒(méi)有出現(xiàn)試管薯之前，所有處理的苗都出現(xiàn)矮化狀態(tài)，而且苗非常粗壯，這可能因?yàn)锽9濃度過(guò)高的原因造成。

3 討論

目前馬鈴薯脫毒產(chǎn)業(yè)中脫毒苗試管快繁是重要的環(huán)節(jié)。馬鈴薯脫毒試管苗生長(zhǎng)較其他組培植物容易，是組織培養(yǎng)中的模式植物[7]。影響試管苗生長(zhǎng)的因素很多，在22 ℃、光強(qiáng)為2 000 ～ 3 000 lx、每日16 h光照條件下生長(zhǎng)使試管苗處最佳溫、光條件，在馬鈴薯脫毒產(chǎn)業(yè)中已達(dá)到共識(shí)。培養(yǎng)基成分直接影響試管苗的生長(zhǎng)，無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物、鐵鹽使植株生長(zhǎng)旺盛，葉片肥厚、根系健壯；激素和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可控制植株根、莖、葉生長(zhǎng)的方向。

謝光新等[4]發(fā)現(xiàn)在MS液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的矮壯素時(shí)，發(fā)現(xiàn)MS + 1.0 mg/L CCC的效果最好，培養(yǎng)出的脫毒苗長(zhǎng)勢(shì)好、節(jié)間短，是進(jìn)行切段繁殖的良好培養(yǎng)基。而陳芝蘭等[5]在莖段快繁中采用了不同濃度的B9，發(fā)現(xiàn)20 mg/L B9其節(jié)間較短，且苗較粗壯；劉尚前[8]也發(fā)現(xiàn)20 mg/L B9對(duì)培養(yǎng)壯苗有很好的影響。此外有報(bào)道表明，在培養(yǎng)基中加入抗生素具有抑菌、殺菌和改善脫毒苗根系生長(zhǎng)的作用[9]。在本研究中主要是采用用B9和CCC進(jìn)行培養(yǎng)壯苗，試驗(yàn)中以40 mg/L B9處理最好，平均生根率為96.25%，脫毒苗在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好。相對(duì)于其他幾個(gè)處理，40 mg/L B9的苗比較粗壯。從這個(gè)結(jié)果來(lái)看，雖然有的處理生根率很高，例如MS + 1.0 mg/L CCC的生根率很高，但是試管苗比較細(xì)弱。如果單獨(dú)采用1 ～ 2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)如生根率，來(lái)評(píng)價(jià)添加激素培育壯苗的效果，是不準(zhǔn)確的。綜合4個(gè)評(píng)價(jià)因子來(lái)看，應(yīng)當(dāng)選擇以MS + 40 mg/L B9培育壯苗，這樣效果最好。

馬鈴薯試管薯的形成和發(fā)育受多種因素影響，當(dāng)外部環(huán)境適宜時(shí)，沒(méi)有任何激素也能形成小薯，但是含有誘導(dǎo)結(jié)薯激素的培養(yǎng)基結(jié)薯晚、結(jié)薯率高，因此添加一定種類和改變外源激素對(duì)試管薯誘導(dǎo)非常必要。張昌偉等[10]認(rèn)為6-BA對(duì)試管薯的誘導(dǎo)有很大的促進(jìn)作用。韋瑩[11]認(rèn)為添加香豆素濃度為25 mg/L誘導(dǎo)試管薯形成作用最顯著，效果最好，結(jié)薯率達(dá)81.25%。羅麗萍等[12]認(rèn)為提高總薯重和平均薯重最優(yōu)組合是MS + 5 mg/L B9+ 黑暗；提高薯數(shù)的最優(yōu)組合是B5 +5 mg/L B9+ 黑暗培養(yǎng)。陳芝蘭[5]在誘導(dǎo)試管薯中發(fā)現(xiàn)以MS + 5 mg/L 6-BA + 200 mg/L B9的試管薯結(jié)試管薯結(jié)的最好，且降低成本。

Dobranszki[6]提出了光照對(duì)誘導(dǎo)試管薯的影響，并提出在短日照處理時(shí)期內(nèi)高的光照強(qiáng)度處理要比其他光照處理試管薯產(chǎn)生的早，高的光照強(qiáng)度能夠縮短試管薯開(kāi)始生長(zhǎng)的時(shí)間，但是這種影響還與光周期處理和基因型有關(guān)。在誘導(dǎo)完成以后，塊莖開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)期，高的光照強(qiáng)度影響不大。劉玲玲[13]也提出了全黑暗處理可以提高試管薯的結(jié)薯率。

本研究中，主要是采用B9結(jié)合光照處理，誘導(dǎo)試管薯。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的黑暗處理都比光周期處理的結(jié)薯率高，結(jié)薯率最高的組合為MS添加200 mg/L B9，黑暗處理20 d，結(jié)薯率為70%。但是在研究中，用B9處理的脫毒苗在前期都停止生長(zhǎng)，苗非常矮小粗壯，這可能是因?yàn)锽9的濃度過(guò)高所致。同時(shí)給研究帶來(lái)了一個(gè)好處，就是在誘導(dǎo)試管薯的過(guò)程中可以使用用100 mL的三角瓶進(jìn)行誘導(dǎo)，而不必采用500 mL大號(hào)三角瓶，這樣可以提高效率并降低成本。

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Q813.1

A

1673-1409(2009)02-S061-04

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.017

2009-03-30

劉 華(1986-)，女，重慶永川人，研究方向?yàn)橹参锝M織培養(yǎng).

姚 振，E-mail:yaozhen@xinhuanet.com.