向 珣，宋小麗，施倩倩(浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部“園藝植物生長(zhǎng)發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控”重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310029)

柴偉國(guó) (浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

曹家樹(shù) (浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部“園藝植物生長(zhǎng)發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控”重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310029)

DNA-AFLP分析用辣椒基因組DNA提取方法的優(yōu)化

向 珣，宋小麗，施倩倩(浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部“園藝植物生長(zhǎng)發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控”重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310029)

柴偉國(guó) (浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

曹家樹(shù) (浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部“園藝植物生長(zhǎng)發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控”重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310029)

采用SDS法、CTAB-1法和CTAB-2法提取辣椒(Capsicumannuum)葉片DNA，通過(guò)紫外吸收和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，證明CTAB-2法所提取DNA的質(zhì)量和純度較高；以此DNA為模板進(jìn)行DNA-AFLP分析，特征條帶清晰、基本無(wú)脫尾，適用于DNA-AFLP等分子生物學(xué)研究。

CTAB；辣椒(Capsicumannuum)；DNA；DNA-AFLP

提取DNA是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，DNA的純度及結(jié)構(gòu)的完整性是進(jìn)行基因工程各項(xiàng)研究所必需的。AFLP標(biāo)記由Vos等[1]發(fā)明，原理是利用一種稀有酶切位點(diǎn)酶和一種豐富酶切位點(diǎn)酶，同時(shí)切割基因組DNA，然后在酶切片段兩端連接上人工接頭，作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板。設(shè)計(jì)的引物和接頭與酶切位點(diǎn)互補(bǔ)，并在3’端加上2 ～ 3個(gè)選擇性堿基，因此在DNA被酶切后的無(wú)數(shù)片段中，只有那些與引物3’端互補(bǔ)的片段才能進(jìn)行擴(kuò)增，稱為選擇性擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在PAGE膠上分離后，通過(guò)銀染等檢測(cè)手段顯示出多態(tài)性豐富的指紋圖譜。該標(biāo)記系統(tǒng)能通過(guò)少量的引物擴(kuò)增產(chǎn)生數(shù)量豐富的帶型標(biāo)記，并且分辨率高，在鑒定遺傳多樣性和物種親緣關(guān)系中具有較大的優(yōu)越性[1]。目前，栽培辣椒(Capsicumannuum)品種種質(zhì)譜系越來(lái)越集中在少數(shù)優(yōu)良種質(zhì)上，導(dǎo)致親緣關(guān)系越來(lái)越近，形態(tài)區(qū)分難度也越來(lái)越大，新品種的新穎性和特異性鑒定缺少依據(jù)，生產(chǎn)上品種的形態(tài)鑒定、新品種的認(rèn)定或?qū)彾ê芾щy。DNA-AFLP構(gòu)建辣椒遺傳圖譜，不僅具有強(qiáng)有力的多態(tài)性檢測(cè)能力，而且所揭示的多態(tài)性DNA產(chǎn)物能被高效地克隆，獲得的分子標(biāo)記可以用于輔助育種及基因文庫(kù)篩選等更深入的遺傳學(xué)研究。

高質(zhì)量的DNA提取，是成功構(gòu)建DNA-AFLP指紋圖譜的前提。模板的質(zhì)量將影響酶切、連接、PCR擴(kuò)增反應(yīng)，而假陽(yáng)性或假陰性不能反映真實(shí)的多態(tài)性[4]。酚類化合物和多糖是影響植物DNA提取的2個(gè)重要因素，常導(dǎo)致DNA降解，影響DNA的純度、產(chǎn)量及DNA聚合酶活性[5]。辣椒葉片富含淀粉和多酚等物質(zhì)，有效去除DNA所含雜質(zhì)(多糖、酚類等)，是提取高質(zhì)量辣椒DNA的關(guān)鍵。因此，本研究在SDS和CTAB法基礎(chǔ)上適當(dāng)加以改良，提取形態(tài)相近、親緣關(guān)系密切的12份辣椒材料DNA，進(jìn)行DNA-AFLP分子標(biāo)記鑒定，以便為區(qū)分它們提供分子指紋證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)苯菲贩N12份，分別是‘采風(fēng)1號(hào)’、‘采風(fēng)3號(hào)’、‘千麗1號(hào)’、‘弄口早椒’、‘杭椒2號(hào)’、‘杭椒3號(hào)’、‘浙椒1號(hào)’、‘雞爪椒’、‘吉林甜椒’、‘9614-1-2’、‘9624-25’和‘ASC0503’，全部來(lái)源于杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所。

1.2 方法

(1)總DNA的提取 基因組DNA提取采用SDS法和CTAB法，略加改進(jìn)[6]。操作如下：從超低溫冰箱中取出材料，稱取0.5 g，加入適量的液氮，在保持葉片冷凍的條件下快速將葉片研磨成粉末；分別用3種抽提緩沖液抽提(表1)；70% ～ 80%冷乙醇洗沉淀2次，再用無(wú)水乙醇漂洗1次，冷凍真空干燥機(jī)抽干；加50 ～ 100 μL ddH2O或TE使沉淀溶解，-20 ℃保存；取5 μL DNA，以 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA質(zhì)量，同時(shí)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量及質(zhì)量。

表1 抽提緩沖液體系Table 1 Extraction buffer systems

(2)DNA-AFLP分析 以CTAB-2法提取的DNA為模板，經(jīng)EcoR Ⅰ、MseⅠ雙酶切，并與MseⅠ、EcoR Ⅰ接頭連接，預(yù)擴(kuò)、選擴(kuò)、聚丙烯酰胺凝膠電泳。所有接頭和引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(表2)。AFLP酶切、連接、擴(kuò)增參照宋小麗等[7](表3、表4)。

表2 DNA-AFLP所用接頭及引物序列Table 2 DNA-AFLP adopters and primers

表3 DNA-AFLP反應(yīng)體系Table 3 DNA-AFLP reaction system

表4 DNA-AFLP擴(kuò)增和電泳程序Table 4 DNA-AFLP amplification and electrophoresis procedures

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒葉片勻漿比較

將葉片加入液氮磨成干粉，加入抽提緩沖液，在65 ℃水浴45 min后比較勻漿的顏色。SDS法勻漿顏色為暗綠色，不透明；CTAB-1法葉片勻漿顏色翠綠且透明，CTAB-2法葉片勻漿顏色比CTAB-1稍暗，但是透明。勻漿綠色且透明是DNA提取質(zhì)量高的標(biāo)志。CTAB法比SDS法除酚類物質(zhì)徹底，其中CTAB-1防止酚類物質(zhì)氧化的能力更強(qiáng)。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

A. SDS法提辣椒基因組DNA; B. CTAB-1法提辣椒基因組DNA; C. CTAB-2法提辣椒基因組DNA; a泳道：‘采風(fēng)1號(hào)’DNA；b泳道：‘采風(fēng)3號(hào)’DNA。圖1 辣椒基因組DNA 0.8%瓊脂糖凝電泳檢測(cè)Figure 1 Electrophoresis of pepper genomic DNA through 0.8% agarose gel

電泳檢測(cè)顯示，采用CTAB-2法提取的DNA純度較高，結(jié)構(gòu)完整、條帶清晰、整齊一致，無(wú)降解現(xiàn)象；SDS法幾乎全部降解，并存在蛋白質(zhì)污染，可能是大量的酚類物質(zhì)降解促進(jìn)了DNA 的降解。CTAB-1法中，DNA條帶模糊不均一，都有不同程度的降解，且有膠狀物聚集于點(diǎn)樣孔，說(shuō)明有多糖和蛋白質(zhì)污染(圖1)。

2.3 紫外吸收檢測(cè)

CTAB-2法提取DNA的D260/D280在1.75 ～ 1.95(表5)，說(shuō)明CTAB-2法提取的DNA紫外吸收曲線具有典型的天然DNA標(biāo)準(zhǔn)吸收光譜，RNA、蛋白質(zhì)去除較好；SDS法提取的DNAD260/D280在1.0 ～ 1.3之間(未列出)，結(jié)合電泳圖可以分析出DNA降解非常嚴(yán)重；CTAB-1法的D260/D280在1.3 ～ 1.7之間，結(jié)合電泳圖可以分析出DNA降解嚴(yán)重而且含部分蛋白質(zhì)。就測(cè)量的DNA濃度而言，SDS法和CTAB-1法測(cè)得的濃度(未列出)比CTAB-2法高很多，都是1 000以上，但這是由于DNA降解的緣故，僅僅數(shù)值不能說(shuō)明問(wèn)題。

表5 CTAB-2提辣椒基因組DNA的濃度和質(zhì)量Table 5 Quantity and quality of pepper genomic DNA extracted by method CTAB-2

2.4 DNA-AFLP分析

對(duì)酶切、連接后的產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)顯示擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定，彌散范圍在100 ～ 1 000 bp之間(圖2)，表明辣椒基因組DNA酶切充分，接頭連接較好。使用5條EcoR Ⅰ引物和5條MseⅠ引物，共25對(duì)引物組合用于構(gòu)建12個(gè)辣椒品種的遺傳圖譜，大部分引物在品種間均能擴(kuò)出差異條帶(圖3)。

M：100 bp標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道1 ～ 12為辣椒品種編號(hào)圖2 連接產(chǎn)物預(yù)擴(kuò)增凝膠電泳檢測(cè)Figure 2 1% agrouse gel electrophoresis of the preamplified productions

3 討論

辣椒葉片富含的酚類物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致DNA降解，與DNA 結(jié)合形成的沉淀物質(zhì)多呈黃色或黑褐色，難以溶解或溶液顏色深，很難得到高純度DNA。由于酚類化合物在植物材料中普遍存在，常出現(xiàn)獲得的DNA產(chǎn)量低、質(zhì)量差、DNA易降解等問(wèn)題，難以滿足相關(guān)的分子分子生物學(xué)研究需求。已有的報(bào)道使用液氮研磨，并在提取液中加入一定量的PVP、巰基乙醇等可去除酚類物質(zhì)的試劑[8,9]。

RAPD是一種有效的分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)DNA用量很少(5 ～ 10 ng)，質(zhì)量要求也不高，操作簡(jiǎn)單。俞文政等[10]采用SDS法、CTAB法和高鹽低pH法對(duì)辣椒葉片DNA進(jìn)行提取，結(jié)果顯示SDS法提取的DNA分子較為完整，能進(jìn)行RAPD分析。Paran 等[11]發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)辣椒多態(tài)性上，AFLP引物是RAPD有效性的4倍，具有信息量大、快速、穩(wěn)定、高效的優(yōu)勢(shì)[12]，但AFLP對(duì)DNA的要求較RAPD高，因?yàn)镈NA需要經(jīng)過(guò)EcoR Ⅰ、MseⅠ雙酶切，并與MseⅠ接頭和EcoR Ⅰ接頭連接，隨后預(yù)擴(kuò)、選擴(kuò)，過(guò)程復(fù)雜且多，提取的DNA質(zhì)量不高會(huì)導(dǎo)致酶切不充分，影響以后的連接擴(kuò)增反應(yīng)，不利于擴(kuò)增。本研究中，SDS法提取的DNA質(zhì)量不高，褐變嚴(yán)重。SDS法中DNA純化雖用氯仿/異戊醇代替酚來(lái)去處變性蛋白，克服酚殘留對(duì)酶切的影響，但SDS本身對(duì)PCR、RAPD等有較大影響。顧紅雅等[13]提出用增大離心速度或延長(zhǎng)離心時(shí)間，也有利于雜質(zhì)的去除，克服SDS法DNA含較多糖類雜質(zhì)的缺點(diǎn)。

與SDS法(0.5 mol·L-1NaC1)相比，CTAB法增加高鹽溶液中鹽的濃度(提取緩沖液中NaC1的濃度提高到1.4 mol·L-1)，使DNA在高鹽緩沖條件下優(yōu)先沉淀，可有效去處多糖。CTAB-1法增加巰基乙醇的含量，同時(shí)加入PVP使其與多酚類物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物。雖然CTAB-1的葉片勻漿比CTAB-2更綠，酚類物質(zhì)去除更好，但過(guò)剩的疏基乙醇導(dǎo)致辣椒葉片DNA得率低，有脫尾，雖能用于普通PCR擴(kuò)增，但由于DNA片斷的斷裂程度較大，在DNA-AFLP分析中譜帶減少、模糊，影響分析效果。

DTT是一種還原劑，有抗氧化作用，與巰基乙醇的作用相似，但DTT的刺激性氣味要小很多，毒性也較巰基乙醇低很多。王巖等[6]利用改良的2×CTAB法(含0.2%DTT)提取辣椒基因組DNA，以此DNA為模板適合于普通PCR分析。本研究CTAB-2法在高鹽緩沖條件下，用0.2%DTT代替CTAB-1法1%PVP-360，并省略了1%的巰基乙醇，結(jié)果顯示改良的CTAB-2提取的基因組DNA產(chǎn)量高、質(zhì)量好，適用DNA-AFLP分析。在高鹽提取緩沖液中加入適量的DTT，能有效地抑制酚類物質(zhì)的氧化，同時(shí)也避免造成DNA的斷裂等一系列的問(wèn)題，為利用DNA-AFLP分析辣椒植物的起源、分類、親緣關(guān)系及品種特征圖譜的建立提供了有力保障。

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Q785

A

1673-1409(2009)02-S048-04

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.014

2009-03-30

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y3080128)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30771377)

向 珣(1973-)，女，四川達(dá)州人，農(nóng)學(xué)博士，講師，從事園藝植物生長(zhǎng)發(fā)育研究.

曹家樹(shù)，Email:jshcao@zju.edu.cn.