李 兵 (華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，湖北 武漢 430070)

曾令兵 (中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 荊州 434000)

RNA干涉技術及其在水產(chǎn)科學中的應用

李 兵 (華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，湖北 武漢 430070)

曾令兵 (中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 荊州 434000)

介紹了RNA干涉的作用機制和特點，從抑制水生動物病毒、研究水生動物基因功能等方面綜述了RNA干涉技術近年在水產(chǎn)科學領域中的應用。

RNA干涉；基因沉默；水產(chǎn)科學；應用

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是指由外源或內源性的小干涉RNA雙鏈分子(Small interferring RNA，siRNA)導入細胞時，引起同源的mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象，又稱為轉錄后基因沉默(post transcriptional gene-silencing，PTGS)[1，2]。

自從1998年Fire等提出RNA干涉以來，人們對它的機制以及功能的研究取得了突飛猛進的發(fā)展。RNA干涉技術具有高度特異性、高效性等特點，為人們研究未知功能的基因提供了新的遺傳學手段，還可以作為一種潛在的抵抗病毒感染的途徑。近年來科學家利用RNA干涉技術在研究水產(chǎn)病原生物控制、魚類基因結構與功能等方面開展卓有成效的研究工作，取得了顯著進展。

1 RNA干涉技術

1.1 RNAi的發(fā)展過程

1998年,Fire等[3]將經(jīng)純化得到的反義RNA或正義RNA注入線蟲，基因抑制效應微弱；而將正、反義鏈構成的雙鏈RNA注入線蟲，結果誘發(fā)了比單獨注射正義鏈或反義鏈都要強得多的基因沉默。由此他們提出，小的雙鏈RNA分子能引起生物體內同源mRNA的降解，導致相應的基因表達沉默，并稱這種現(xiàn)象為RNA干涉。

Wianny[4]發(fā)現(xiàn) RNA干涉也存在于小鼠中。Clemens等[5]發(fā)現(xiàn)RNA干涉在體外培養(yǎng)的果蠅細胞系中也能實現(xiàn)。Brummelkamp等[6]利用載體表達的小發(fā)卡狀RNA(small hairpin RNA，shRNA)在培養(yǎng)的人源、猴源和鼠源等哺乳動物細胞的RNAi實驗中取得了成功。Tuschl等[7]發(fā)現(xiàn)小的RNA干涉分子(small interferring RNA，siRNA)能在人胚胎腎293細胞和Hela細胞內有效地抑制目的基因的表達。McCaffrey等[8]通過載體表達的shRNA在小鼠中成功抑制了HBV復制。Song等[9]針對小鼠Fas mRNA設計了siRNA，成功地保護了小鼠的肝臟。Anderson等[10]、Nishitsuji等[11]、Li等[12]、Tat等[13]分別利用RNA干涉原理有效地抑制了HIV-1的復制，為HIV-1的治療提供了可能的途徑。

1.2 RNAi的作用機制

RNAi的發(fā)生過程大致可以分為3個階段，分別是起始階段、效應階段和擴增階段。在起始階段，外源導入或病毒感染等方式引入的dsRNA被核酸內切酶RNaseIII家族的Dicer所識別并均勻地切割成21～23 nt大小的siRNA。內源microRNA原始轉錄產(chǎn)物(pri-microRNA)在核酸內切酶Drosha的作用下形成microRNA前體(pre-microRNA)，然后被Dicer識別并結合，加工成類似siRNA的成熟microRNA[14]。在效應階段，siRNA與蛋白復合物結合后形成RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC中的解旋酶利用ATP解開siRNA雙鏈，反義鏈與Argonaute蛋白形成活化的RISC，活化的RISC與互補的靶mRNA結合，在酶的催化作用下，將其切割、降解[15]。在線蟲和植物中存在這種siRNA的擴增機制。在這個階段，siRNA與mRNA靶向性結合，并作為引物，在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)作用下再次形成dsRNA，dsRNA又被Dicer切割成siRNA，新形成的siRNA又可以進入下一輪循環(huán)而達到擴增目的[16]。

1.3 RNAi的特點

RNAi具有以下幾個主要的特點：(1)高度特異性。RNAi作用只降解與其序列同源的靶mRNA分子。(2)高效性。由于RNAi過程中存在信號分子擴增機制，極少量的dsRNA就可以引起靶mRNA分子的降解[16]。(3)作用迅速。dsRNA導入細胞后可迅速引起與其同源的mRNA的降解。(4)能抑制靜息期的病毒。RNAi的作用不依賴于病毒的復制，利用慢病毒載體表達的RNAi可以抑制處在靜息期的病毒的基因表達。(5)能同時抑制多個基因。針對一個基因家族的保守序列設計siRNA能同時抑制該基因家族里的多個基因的表達。(6)操作簡便。相對基因敲除技術而言，RNAi的操作更為簡便，更易于控制。

1.4 siRNA的制備

制備siRNA較為常用的方法有化學合成法、體外轉錄法、長片斷dsRNAs經(jīng)Rnase Ⅲ類降解體外制備siRNA法、通過siRNA表達載體或者病毒載體制備siRNA以及通過PCR法制備的siRNA表達框架等。各方法的優(yōu)缺點見表1。

表1 siRNA制備方法的比較Table 1 Comparison on methods of siRNA preparation

1.5 RNAi技術的應用

RNAi具有廣泛的用途，例如用于基因功能解析、生物遺傳育種、腫瘤與傳染性疾病治療、新型藥物篩選、細胞信號傳導途徑、生長與發(fā)育機理等方面的研究。外源導入siRNA使生物體內同源的基因沉默而表現(xiàn)為相應的功能缺失的表型，就可以確定該基因的功能。在基因治療研究中，選擇病原生物、腫瘤細胞或遺傳性、代謝性疾病特有的基因靶序列，設計siRNA并導入目標生物體內，從而引發(fā)RNA干涉，抑制靶基因的表達，達到基因治療的目的。Gitlin等[24]發(fā)現(xiàn)，用siRNA預處理的人或鼠細胞能夠抵抗脊髓灰質炎病毒感染，已感染脊髓灰質炎病毒細胞中導入siRNA有利于病毒的清除。RNAi可以作為尋找新的基因治療藥物靶標的工具，高通量地對藥物靶基因作功能和效果分析。美國Genetica公司已將RNAi技術作為高通量藥物靶標識別和確認的工具[25]。由于RNAi能高效地阻斷目的基因的表達，因此RNAi技術可以作為研究信號傳導通路的良好工具。Deng等[26]通過RNAi技術證實Mirk激酶在骨骼肌細胞分化過程中受Rho家族成員調控，聯(lián)合應用傳統(tǒng)突變缺失技術和RNAi技術可以很容易地確定復雜信號傳導通路中不同基因的上下游關系。

2 RNAi在抑制水產(chǎn)動物病毒復制方面的應用

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，水產(chǎn)動物病害愈加頻繁的發(fā)生。大規(guī)模疾病的暴發(fā)不僅造成了巨大的經(jīng)濟損失，由此滋生的濫用藥物問題給食品安全帶來了巨大的隱患，嚴重阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展。因此，有效控制水產(chǎn)動物病害的發(fā)生成為當務之急。但是，目前對水產(chǎn)動物疾病，尤其是病毒性疾病缺乏有效地防治方法，常規(guī)的藥物防治不能有效控制疾病的發(fā)生，而且容易引起藥物殘留等問題。而小的RNA干涉分子能特異性地抑制同源基因的表達，利用RNAi干涉技術，通過外源導入siRNA可以在水產(chǎn)動物體內有效地降解病毒的RNA，達到防治病毒性疾病的目的。

2.1 抑制真鯛虹彩病毒

真鯛虹彩病毒能感染真鯛等海水養(yǎng)殖魚類，造成較大的經(jīng)濟損失。目前對真鯛虹彩病毒還沒有很好的抑制方法，因此很有必要研究一種新的途徑來抑制真鯛虹彩病毒的復制。真鯛虹彩病毒是一種雙鏈DNA病毒，病毒基因組編碼一個主衣殼蛋白(major capsid protein，MCP)基因和92個推定的開放讀碼框架。Lua等[27]針對真鯛虹彩病毒(Red seabream iridovirus，RSIV)的主衣殼蛋白基因設計siRNA(siR-MCP)，用不同濃度的siR-MCP(30、60 和120 nmol/L)和MCP表達質粒共轉染比目魚胚胎細胞(Hirame Natural Embryo，HINAE)2 d后，經(jīng)過RT-PCR的檢測發(fā)現(xiàn)，120 nmol/L的siR-MCP能有效地抑制MCP基因的瞬時表達(表達量減少了79.55%)。用120 nmol/L的siR-MCP轉染HINAE細胞6 h后，用RSIV感染HINAE細胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h、84 h、96 h后，經(jīng)過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，RSIV的復制分別減少了13.04%、55.16%、97.14%。研究表明，通過siR-MCP抑制MCP基因的表達可以有效地抑制RSIV的復制。用siR-MCP轉染HINAE細胞，接毒72 h、96 h、120 h后對細胞培養(yǎng)液的上清進行滴度測定，發(fā)現(xiàn)病毒的數(shù)量與對照組相比有所下降，表明siR-MCP有抗病毒的特性。由此提示RNA干涉技術可為水產(chǎn)動物病毒性疾病的防治提供了一種新的途徑。

2.2 抑制對蝦白斑綜合癥病毒

對蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，是造成世界范圍內大面積暴發(fā)對蝦病毒性疾病的主要病原。病毒感染蝦后3～7 d內死亡率高達100%，對對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的危害。WSSV的基因組大小約為300 kb，由6個主蛋白和大約34個輔助蛋白組成。Westenberg等[28]針對對蝦白斑綜合癥病毒包膜蛋白vp28和DNA綁定蛋白vp15設計了siRNA并注射到對蝦體內，24 h后感染 WSSV病毒。發(fā)現(xiàn)siRNA能降低有效地抑制目的基因的表達，降低對蝦的死亡率。Wu等[29]針對凡納濱對蝦白斑綜合癥病毒5個基因位點DNA 聚合酶(dnapol)，核苷酸還原酶小亞基(rr2)，胸苷激酶-胸苷酸激酶(tk-tmk)，核衣殼蛋白vp24以及包膜蛋白vp28設計了siRNA，將siRNA和WSSV注射到凡納濱對蝦第三腹節(jié)和第四腹節(jié)之間的肌肉組織，暫養(yǎng)6 d后，成活率分別為50%、50%、66%、33% 和33%，而對照組成活率為0%。說明siRNA對白斑綜合癥病毒的復制有一定的抑制作用，展示RNA干涉技術在防治病毒性疾病、尤其是目前尚無有效對策進行控制的病毒性疾病的廣闊應用前景。

2.3 抑制蛙病毒

虎紋蛙虹彩病毒(Iridovirus-tiger frog virus，TFV)屬于虹彩病毒科、蛙病毒屬。虎紋蛙虹彩病毒主要感染虎紋蛙幼體和幼蛙，導致其大量死亡，造成重大的經(jīng)濟損失?；⒓y蛙虹彩病毒免疫原性很低，疫苗接種的效果一般都不理想。RNA干涉作用具有高效降解同源mRNA的特點，解決了這一難題。Xie等[30]針對虎紋蛙虹彩病毒主衣殼蛋白基因設計的siRNA對病毒的復制有強烈的抑制作用。siRNA能導致TFV感染的細胞出現(xiàn)CPE的時間推遲。病毒感染后的細胞培養(yǎng)液中病毒的滴度和病毒粒子的含量均有下降。提示RNA干涉技術可以用于抑制虎紋蛙虹彩病毒的復制。他們還通過體外轉錄siRNA以及質粒轉導shRNA在肥頭鯉肌肉細胞(FHM)中有效地抑制了報告基因lacZ的表達，而且發(fā)現(xiàn)siRNA更為有效。

2.4 抑制草魚呼腸孤病毒

草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)主要感染當年草魚種，在水溫25～30 ℃最為流行，死亡率高。草魚呼腸孤病毒為雙鏈RNA病毒，其基因組由11個片段組成。陳蕓[31]以草魚呼腸孤病毒外殼蛋白基因VP7為靶基因，構建了shRNA表達載體。轉染草魚腎細胞(CIK)后，用GCRV感染CIK細胞。結果顯示，shRNA表達載體在細胞水平上對GCRV具有較強的病毒抑制作用，抑制率達82%。他們采用顯微注射將shRNA表達載體導入稀有鮈鯽體內。結果表明，針對GCRV的VP7基因設計的shRNA表達載體有效地抑制了GCRV在稀有鮈鯽體內的復制。

3 RNAi在水產(chǎn)動物基因功能研究方面的應用

Li等[32]發(fā)現(xiàn)特異性的siRNA能有效地抑制斑馬魚胚胎中外源的綠色熒光蛋白的瞬時表達。針對Zf-T基因設計的siRNA通過顯微注射到斑馬魚胚胎中，導致脊索發(fā)育畸形，尾部嚴重萎縮。 針對Pax6.1基因設計的siRNA導致斑馬魚胚胎眼和前腦發(fā)育不良。同時注射2種siRNA導致胚胎缺少脊索、眼以及部分腦組織。因此可以推測Zf-T基因與脊索的發(fā)育密切相關，Pax6.1基因在眼和腦組織的發(fā)育過程中起到了重要的作用。Dodd等[17]首次研究了siRNA對斑馬魚肌營養(yǎng)不良蛋白基因(dmdgene)的作用效果，應用化學合成的siRNA注射到斑馬魚胚胎中，成功抑制了dmd基因的表達。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)運用核酶消化長片段dsRNA得到的siRNA能夠引起非特異性的基因表達抑制，而運用SP6 RNA聚合酶進行體外合成得到的siRNA能夠特異性的沉默靶基因的表達，說明體外轉錄的siRNA可以在斑馬魚中用來特異性地下調目的基因表達。這提示RNA干涉技術在斑馬魚基因功能研究中有著廣泛的應用前景。

Boonanuntanasarn等[33]發(fā)現(xiàn)序列特異性的siRNA能有效地抑制虹鱒胚胎中綠色熒光蛋白基因的瞬時表達，有4個堿基錯配的siRNA沒有抑制效果。這說明siRNA的抑制作用具有高度特異性。針對酪氨酸酶A基因設計的siRNA，有效地抑制了酪氨酸酶A基因的表達，而且siRNA的抑制作用具有劑量依賴性。Robalino等[34]針對凡納濱對蝦的血藍蛋白基因設計的dsRNA注射到對蝦尾部肌肉，經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，dsRNA在肝胰腺中有效地抑制了血藍蛋白mRNA的表達。說明dsRNA可以在對蝦不同的組織間進行傳遞；對蝦體內存在著完整的RNAi機制，因此RNA干涉技術可以用于研究對蝦的基因功能。

Jannel等[35]通過體外轉錄法合成了針對羅非魚肌生成抑制素myostatin基因設計的siRNA，通過顯微注射到斑馬魚的晶胚中。在顯微注射30 d、60 d和75 d后對所有魚體進行稱重，每組分別取20個個體進行肌肉的組織學分析。結果表明，注射了siRNA的斑馬魚與對照組相比，體重增長達到45%，肌纖維含量平均增長了48.7%。說明siRNA有效抑制了myostatin基因的表達，也提示RNA干涉技術可以用于培育個體大、肌纖維含量高的優(yōu)良品種。

Zenke等[36]利用紅鰭東方鲀的U6啟動子成功的在藍色大太陽魚細胞系中轉錄了shRNA，并證實了在藍色大太陽魚細胞系、石鱸鰭條細胞系以及大鱗大麻哈魚胚胎細胞系中紅鰭東方鲀的U6啟動子比鼠的U6啟動子能更有效地表達shRNA。Voelker等[37]利用RNAi技術抑制斑馬魚胚胎細胞色素cyp1a基因和血紅素氧合酶1基因(hmox1)的表達，并將胚胎用3,4-氯苯胺(3,4-dichloroaniline)處理。結果胚胎發(fā)育紊亂的幾率有所提高；而注射cyp1a和hmox1的mRNA減少了胚胎發(fā)育紊亂發(fā)生的幾率。2種處理揭示了cyp1a和hmox1基因表達的蛋白對暴露于3,4-氯苯胺中的斑馬魚胚胎具有保護作用。進一步展示RNA干涉技術在基因功能研究方面的應用前景。

Su等[38]通過shRNA抑制斑馬魚綠色熒光蛋白基因和無尾基因的實驗發(fā)現(xiàn)，相對于單獨使用CMV啟動子或者U6啟動子而言，將CMV增強子或者整個CMV啟動子定位于U6啟動子的上游可以顯著地增強shRNA對目的基因的抑制效果。Wang等[39]通過T7質粒系統(tǒng)體內轉錄小發(fā)夾RNA，有效地抑制了斑馬魚胚胎中綠色熒光蛋白基因和無尾(no tail)基因的表達。提示T7質粒系統(tǒng)體內轉錄小發(fā)夾RNA可應用于斑馬魚胚胎的基因功能研究。Schyth等[40]針對1種魚類棒狀病毒的糖蛋白基因設計了3種不同的siRNA，經(jīng)病毒感染的細胞轉染siRNA，結果顯示3種siRNA均能有效地抑制病毒的增殖，而含1～4個堿基錯配的siRNA，有2/3能對病毒起到抑制作用，說明siRNA的作用具有序列特異性。Hwang等[41]發(fā)現(xiàn)傳染性胰腺壞死癥病毒(infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)能誘導大麻哈魚細胞產(chǎn)生一種新型的膜聯(lián)蛋白1(annexin1)。他們針對膜聯(lián)蛋白1設計了siRNA，有效地抑制了膜聯(lián)蛋白1的mRNA的表達，經(jīng)IPNV感染的細胞的凋亡現(xiàn)象顯著增加，細胞外的病毒減少至25%。揭示大麻哈魚膜聯(lián)蛋白1的抗細胞凋亡作用對IPNV在細胞中的增殖十分重要。

4 問題與展望

RNAi具有高效性、特異性等諸多特點，在抑制特定基因的表達方面具有很大的優(yōu)越性。RNAi技術可以廣泛應用于水產(chǎn)動物基因結構與功能分析、細胞信號傳導途徑以及病原生物抑制與疫病控制等方面。由于化學合成siRNA的成本較高，且直接應用化學合成的siRNA其作用時效比較短，只適用于在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中用于篩選或鑒定有效siRNA結構。利用質粒轉錄或載體表達技術在魚類細胞或魚體內持續(xù)穩(wěn)定高效表達siRNA結構，對于RNAi技術在魚類傳染性疾病的基因治療、水產(chǎn)動物轉基因新品種培育、遺傳性狀連鎖基因定位、動物發(fā)育生物學等領域的應用有重要意義，是今后的研究于在水產(chǎn)科學中應用的發(fā)展方向。相信隨著研究的不斷深入，RNAi技術一定會在水產(chǎn)科學領域得到更加廣泛的應用和取得更大的成果。

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Q789

A

1673-1409(2009)02-S042-06

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.013

2008-11-11

李 兵(1983-)，男，湖北麻城人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究.

曾令兵，E-mail：zenglingbing@gmail.com.