李 孌 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

蔣道松，周樸華 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

富貴菜離體培養(yǎng)體系的建立

李 孌 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

蔣道松，周樸華 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

富貴菜(Gynuradivaricata)離體培養(yǎng)研究結(jié)果表明，以幼葉為外植體，最適致密愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ KT 0.4 mg·L-1+ 蔗糖3%，誘導(dǎo)率為95.9%；最適誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基為改良MS + 6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+ 蔗糖3.0%，分化率為88%，增殖系數(shù)12.60；最適生根培養(yǎng)基為1/2改良MS + NAA 0.3 mg·L-1+ 蔗糖3%，生根率為100%；經(jīng)該途徑誘導(dǎo)得到的植株，經(jīng)煉苗后移栽成活率≥93%。

富貴菜(Gynuradivaricata)；離體培養(yǎng)；植株再生

富貴菜(Gynuradivaricata)含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，作為一種保健蔬菜開(kāi)發(fā)，市場(chǎng)前景廣闊[1]。但目前富貴菜在國(guó)內(nèi)的種植及推廣有限，即南方種植比較多，北方極為少見(jiàn)，主要原因有2個(gè)方面，一是與富貴菜的生長(zhǎng)環(huán)境要求有關(guān)，有資料記載富貴菜的生長(zhǎng)適溫為20～30 ℃，低于15 ℃莖葉生長(zhǎng)緩慢，最低的耐受溫度為3 ℃，-2 ℃以下時(shí)地上部分及地下莖凍死[2]，二是由于富貴菜經(jīng)常采收的植株不見(jiàn)開(kāi)花，很少結(jié)籽；另有報(bào)道在廣東南部珠江三角洲地區(qū)只開(kāi)花不結(jié)籽[3,4]。這給富貴菜的種質(zhì)資源保存和運(yùn)輸帶來(lái)了一定的困難。隨著人民生活水平的提高，對(duì)富貴菜的需求越來(lái)越大，但傳統(tǒng)的人工扦插繁殖制約著富貴菜的大規(guī)模種植。

本研究旨在通過(guò)富貴菜再生體系的建立，探究在富貴菜組織培養(yǎng)過(guò)程中植物材料、培養(yǎng)基成分、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及培養(yǎng)條件諸因素之間的相互作用，最終尋找到一條繁殖系數(shù)高、周期短、不受季節(jié)限制的快繁途徑，以適應(yīng)工廠化生產(chǎn)的要求。

1 材料與方法

1.1 材料處理

供試材料引種自湖南株洲，9月上旬，取富貴菜葉片為外植體，先將材料用70%的酒精浸泡15 s，后置于0.1% HgCl2溶液中6 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，切去葉片邊緣，大小1 cm × 1 cm。分別接種于添加不同濃度2,4-D、NAA、6-BA，KT的改良MS中(濃度的蔗糖3%，瓊脂0.7%，pH 5.8～6.0)。置于(25±2) ℃的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)。光照強(qiáng)度:誘導(dǎo)愈傷時(shí)250～350 lx，后轉(zhuǎn)入2 000～2 500 lx，光照時(shí)間14 h·d-1，培養(yǎng)室濕度保持在75～85%。

1.2 富貴菜愈傷組織的誘導(dǎo)

在以上提供的基本培養(yǎng)基上，進(jìn)行4因素4水平L16(44)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素和水平詳見(jiàn)表1。每種處理5瓶,每瓶6個(gè)，重復(fù)3次，20 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率結(jié)果。

1.3 富貴菜愈傷組織的分化與增殖

將誘導(dǎo)的愈傷組織塊接種于附加不同濃度配比的6-BA、NAA和蔗糖的改良MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。選用3因素4水平L16(43)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其中因素和水平詳見(jiàn)表2。每種處理5瓶,每瓶6個(gè)，重復(fù)3次，20 d后調(diào)查分化率、增殖率以及生長(zhǎng)情況。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)供試因素及水平Table 1 Factors and levels for callus induction

表2 誘導(dǎo)供試因素及水平Table 2 Factors and levels for induction

1.4 不同激素濃度對(duì)富貴菜生根的影響

當(dāng)芽高約1～2 cm時(shí)，單株切下，轉(zhuǎn)接到附加不同濃度的NAA、IAA的1/2MS培養(yǎng)基中，12 d后觀察生長(zhǎng)情況,并統(tǒng)計(jì)生根率(生根率=生根的富貴菜數(shù)/接種富貴菜數(shù))。每種處理5瓶，共重復(fù)2次。

1.5 富貴菜的煉苗與移栽

富貴菜在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后，苗高5 cm左右。打開(kāi)培養(yǎng)瓶蓋，將培養(yǎng)瓶移至自然光下煉苗2～3 d。選取50株健壯植株，去根部培養(yǎng)基及褐化的老根，分株移栽至裝有細(xì)砂的混合培養(yǎng)基質(zhì)中，待苗生長(zhǎng)健壯后，定植于大田，統(tǒng)計(jì)成活率。重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度組合對(duì)富貴菜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。K值結(jié)果顯示，最佳搭配為改良A3B2C3D3，即MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.5 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ KT 0.4 mg·L-1，然而該組合并未出現(xiàn)在16組試驗(yàn)方案中。在16組實(shí)驗(yàn)方案中第9號(hào)方案MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ KT 0.4 mg·L-1愈傷組織誘導(dǎo)率為最高值95.9%(圖1-1)。將第9號(hào)方案與最優(yōu)水平進(jìn)行比較，不論從愈傷誘導(dǎo)效果，還是激素濃度配比來(lái)看都比較接近。故選擇改良MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ KT 0.4 mg·L-1為最佳培養(yǎng)基。

表3 愈傷組織誘導(dǎo)的試驗(yàn)L16(44)結(jié)果Table 3 The orthogonal test L16(44) results of callus induction

1.增殖后的致密愈傷組織；2.愈傷組織分化為不定芽；3、4.生根的試管苗；5.煉苗；6.移栽一個(gè)月后的試管苗圖1 富貴菜離體培養(yǎng)結(jié)果Figure Resuts of in vitro culture of Gynura divaricata

2.2 不同激素濃度組合對(duì)富貴菜愈傷組織分化的影響

挑選出質(zhì)地均一的愈傷組織，切成1.0 cm見(jiàn)方大小轉(zhuǎn)接到含不同濃度激素的培養(yǎng)基中，1周后愈傷組織上開(kāi)始出現(xiàn)綠色的小芽點(diǎn)，20 d后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 愈傷組織分化的正交試驗(yàn)L16(43)結(jié)果Table 4 The orthogonal test L16(43) results of callus differentiation

由表4可知，K值顯示的最佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基組合為A3B2C3，即改良MS + 6-BA 3.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 蔗糖3.0%。從表4還可知,在富貴菜愈傷組織的分化中，6-BA仍起著關(guān)鍵性的作用。單獨(dú)使用6-BA很難分化出苗，僅使愈傷組織變綠、變硬 。高濃度(gt;4.0 mg·L-1)的6-BA抑制芽的生長(zhǎng),形成的芽矮小且顏色暗綠發(fā)黃；低濃度(lt;1.0 mg·L-1)的6-BA盡管在NAA、KT不同濃度的配合下也能使愈傷組織分化，但誘導(dǎo)低；適宜濃度(3.0 mg·L-1)的6-BA既可以保持較高的多芽數(shù)，又使芽健壯，葉片平展，葉色濃綠。

從因素NAA來(lái)看，濃度在0.1～1.0 mg·L-1的范圍內(nèi)，其誘導(dǎo)率變化不明顯，但由于考慮到生長(zhǎng)素對(duì)芽的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，故建議采用低濃度為宜。蔗糖濃度的大小對(duì)芽的分化也有較大的影響，太高或太低都不利于芽的分化，原因可能是由于滲透壓的改變而造成的。在16組試驗(yàn)數(shù)據(jù)中，9號(hào)配方改良MS + 6-BA 3.0 mg·L-1+ NAA 0.1mg·L-1+蔗糖3.0%，誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)都是最高的，且植株生長(zhǎng)旺盛，很少出現(xiàn)褐化現(xiàn)象(圖1-2)，與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最佳分化組合基本吻合，因此，9號(hào)培養(yǎng)基可以視為富貴菜誘導(dǎo)分化、增殖最適培養(yǎng)基。

2.3 不同激素濃度對(duì)富貴菜生根的影響

不同培養(yǎng)基對(duì)富貴菜試管苗生根的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，激素IAA與NAA都能使富貴菜的試管苗生根。在只含有IAA的培養(yǎng)基中，隨著IAA濃度的增大，生根率升高，生根條數(shù)增多，根相對(duì)較細(xì)，容易生成氣生根。而在只含有NAA的培養(yǎng)基中，濃度為0.1～0.3 mg·L-1時(shí)，生根率均可以達(dá)到100%，植株長(zhǎng)勢(shì)旺盛；NAA濃度較高時(shí)，生根率降低，根系生長(zhǎng)慢，且易對(duì)植物造成毒害。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，IAA、NAA配合使用，其生根率并不高，多氣生根，植株矮小。因此最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.3 mg·L-1+蔗糖3%(圖1-3、圖1-4)。

表5 不定根誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The experiment result of root induction

2.4 富貴菜的煉苗與移栽

當(dāng)試管苗根長(zhǎng)到3～5 cm時(shí)，煉苗2～3 d，將根系上的培養(yǎng)基洗凈，植入腐殖土∶細(xì)沙=3∶1中，栽后用微噴法澆透水，使用塑料薄膜蓋好，相對(duì)濕度保持在75%以上，開(kāi)始時(shí)每天噴水1～2次，7 d后逐漸轉(zhuǎn)入正常管理，成活率≥93%(圖1-5、圖1-6)。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)對(duì)富貴菜離體培養(yǎng)再生體系的建立，得到了最佳培養(yǎng)條件及最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比，解決了該種種質(zhì)資源的保存與繁殖問(wèn)題，為富貴菜試管苗工廠化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)可靠的基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在完全黑暗的條件下，愈傷組織很難分化成不定芽，而是直接生根。說(shuō)明光對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)起著直接的作用，影響器官的形成。光照越強(qiáng)，愈傷褐化程度越高，這可能與組培初代培養(yǎng)過(guò)程中植物內(nèi)源激素水平、培養(yǎng)物多酚氧化酶(PPO)活性及總酚含量有著密切的關(guān)系[5]。

愈傷誘導(dǎo)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：(1)以葉片為外植體，添加6-BA有利于形成致密的愈傷組織，且在一定范圍內(nèi)隨濃度的加大而誘導(dǎo)率升高(因?yàn)?-BA解除了腋芽由生長(zhǎng)素所引起的頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)其產(chǎn)生新的芽點(diǎn)或愈傷組織)；而添加2,4-D雖能誘導(dǎo)疏松愈傷組織，卻對(duì)致密愈傷組織的形成有較強(qiáng)的抑制作用。(2)6-BA與較低濃度的KT、NAA配合使用，可得到質(zhì)量好、誘導(dǎo)率高、適宜分化的致密愈傷組織。

不定芽誘導(dǎo)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：(1)6-BA的濃度變化對(duì)富貴菜致密愈傷組織誘導(dǎo)分化形成不定芽的影響最為顯著。一定范圍內(nèi)，濃度越高，誘導(dǎo)率越大，但高濃度的6-BA則明顯抑制芽的分化；比較而言，分化培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的濃度高于誘導(dǎo)培養(yǎng)基的，有利于芽的產(chǎn)生。(2)3%蔗糖濃度有利于富貴菜誘導(dǎo)、分化；濃度過(guò)低，愈傷組織相對(duì)疏松，不易形成芽點(diǎn)；濃度過(guò)高，易使愈傷組織褐化，出現(xiàn)衰老。

生根試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將無(wú)菌苗插入土壤基質(zhì)比無(wú)激素的培養(yǎng)基中高，這可能與栽培物質(zhì)的透氣性有關(guān)，并且說(shuō)明該植株體內(nèi)，內(nèi)源激素特別是生長(zhǎng)素水平較高。因此在離體培養(yǎng)生根中，需借助于一些外源激素生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)如NAA、IAA等。其中NAA更利于富貴菜無(wú)菌苗菜的生根。適宜濃度NAA誘導(dǎo)，根粗而長(zhǎng)，植株生長(zhǎng)旺盛；雖然IAA同樣能誘導(dǎo)生根，但根細(xì)而短，多氣生根；同時(shí)使用兩種激素誘導(dǎo)生根效果不佳，原因還需進(jìn)一步探討。

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Q813.1

A

1673-1409(2009)02-S056-05

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.016

2009-06-08

李 孌 (1981-)，女(苗族)， 湖南沅陵人，理學(xué)碩士，助教， 研究方向?yàn)榧?xì)胞工程與資源植物學(xué).

蔣道松，E-mail：roadpine@163.com.