李 孌 (湖南農業(yè)大學東方科技學院，湖南 長沙 410128)

蔣道松，周樸華 (湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

富貴菜離體培養(yǎng)體系的建立

李 孌 (湖南農業(yè)大學東方科技學院，湖南 長沙 410128)

蔣道松，周樸華 (湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

富貴菜(Gynuradivaricata)離體培養(yǎng)研究結果表明，以幼葉為外植體，最適致密愈傷組織誘導培養(yǎng)基為改良MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ KT 0.4 mg·L-1+ 蔗糖3%，誘導率為95.9%；最適誘導增殖培養(yǎng)基為改良MS + 6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+ 蔗糖3.0%，分化率為88%，增殖系數(shù)12.60；最適生根培養(yǎng)基為1/2改良MS + NAA 0.3 mg·L-1+ 蔗糖3%，生根率為100%；經(jīng)該途徑誘導得到的植株，經(jīng)煉苗后移栽成活率≥93%。

富貴菜(Gynuradivaricata)；離體培養(yǎng)；植株再生

富貴菜(Gynuradivaricata)含有豐富的黃酮類化合物，作為一種保健蔬菜開發(fā)，市場前景廣闊[1]。但目前富貴菜在國內的種植及推廣有限，即南方種植比較多，北方極為少見，主要原因有2個方面，一是與富貴菜的生長環(huán)境要求有關，有資料記載富貴菜的生長適溫為20～30 ℃，低于15 ℃莖葉生長緩慢，最低的耐受溫度為3 ℃，-2 ℃以下時地上部分及地下莖凍死[2]，二是由于富貴菜經(jīng)常采收的植株不見開花，很少結籽；另有報道在廣東南部珠江三角洲地區(qū)只開花不結籽[3,4]。這給富貴菜的種質資源保存和運輸帶來了一定的困難。隨著人民生活水平的提高，對富貴菜的需求越來越大，但傳統(tǒng)的人工扦插繁殖制約著富貴菜的大規(guī)模種植。

本研究旨在通過富貴菜再生體系的建立，探究在富貴菜組織培養(yǎng)過程中植物材料、培養(yǎng)基成分、植物生長調節(jié)劑以及培養(yǎng)條件諸因素之間的相互作用，最終尋找到一條繁殖系數(shù)高、周期短、不受季節(jié)限制的快繁途徑，以適應工廠化生產的要求。

1 材料與方法

1.1 材料處理

供試材料引種自湖南株洲，9月上旬，取富貴菜葉片為外植體，先將材料用70%的酒精浸泡15 s，后置于0.1% HgCl2溶液中6 min，無菌水沖洗3～5次，切去葉片邊緣，大小1 cm × 1 cm。分別接種于添加不同濃度2,4-D、NAA、6-BA，KT的改良MS中(濃度的蔗糖3%，瓊脂0.7%，pH 5.8～6.0)。置于(25±2) ℃的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)。光照強度:誘導愈傷時250～350 lx，后轉入2 000～2 500 lx，光照時間14 h·d-1，培養(yǎng)室濕度保持在75～85%。

1.2 富貴菜愈傷組織的誘導

在以上提供的基本培養(yǎng)基上，進行4因素4水平L16(44)的正交試驗設計，其因素和水平詳見表1。每種處理5瓶,每瓶6個，重復3次，20 d后統(tǒng)計誘導率結果。

1.3 富貴菜愈傷組織的分化與增殖

將誘導的愈傷組織塊接種于附加不同濃度配比的6-BA、NAA和蔗糖的改良MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。選用3因素4水平L16(43)的正交試驗設計，其中因素和水平詳見表2。每種處理5瓶,每瓶6個，重復3次，20 d后調查分化率、增殖率以及生長情況。

表1 愈傷組織誘導供試因素及水平Table 1 Factors and levels for callus induction

表2 誘導供試因素及水平Table 2 Factors and levels for induction

1.4 不同激素濃度對富貴菜生根的影響

當芽高約1～2 cm時，單株切下，轉接到附加不同濃度的NAA、IAA的1/2MS培養(yǎng)基中，12 d后觀察生長情況,并統(tǒng)計生根率(生根率=生根的富貴菜數(shù)/接種富貴菜數(shù))。每種處理5瓶，共重復2次。

1.5 富貴菜的煉苗與移栽

富貴菜在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后，苗高5 cm左右。打開培養(yǎng)瓶蓋，將培養(yǎng)瓶移至自然光下煉苗2～3 d。選取50株健壯植株，去根部培養(yǎng)基及褐化的老根，分株移栽至裝有細砂的混合培養(yǎng)基質中，待苗生長健壯后，定植于大田，統(tǒng)計成活率。重復2次。

2 結果與分析

2.1 不同激素濃度組合對富貴菜愈傷組織誘導的影響

正交試驗結果見表3。K值結果顯示，最佳搭配為改良A3B2C3D3，即MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.5 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ KT 0.4 mg·L-1，然而該組合并未出現(xiàn)在16組試驗方案中。在16組實驗方案中第9號方案MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ KT 0.4 mg·L-1愈傷組織誘導率為最高值95.9%(圖1-1)。將第9號方案與最優(yōu)水平進行比較，不論從愈傷誘導效果，還是激素濃度配比來看都比較接近。故選擇改良MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ KT 0.4 mg·L-1為最佳培養(yǎng)基。

表3 愈傷組織誘導的試驗L16(44)結果Table 3 The orthogonal test L16(44) results of callus induction

1.增殖后的致密愈傷組織；2.愈傷組織分化為不定芽；3、4.生根的試管苗；5.煉苗；6.移栽一個月后的試管苗圖1 富貴菜離體培養(yǎng)結果Figure Resuts of in vitro culture of Gynura divaricata

2.2 不同激素濃度組合對富貴菜愈傷組織分化的影響

挑選出質地均一的愈傷組織，切成1.0 cm見方大小轉接到含不同濃度激素的培養(yǎng)基中，1周后愈傷組織上開始出現(xiàn)綠色的小芽點，20 d后的統(tǒng)計結果見表4。

表4 愈傷組織分化的正交試驗L16(43)結果Table 4 The orthogonal test L16(43) results of callus differentiation

由表4可知，K值顯示的最佳誘導分化培養(yǎng)基組合為A3B2C3，即改良MS + 6-BA 3.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 蔗糖3.0%。從表4還可知,在富貴菜愈傷組織的分化中，6-BA仍起著關鍵性的作用。單獨使用6-BA很難分化出苗，僅使愈傷組織變綠、變硬 。高濃度(gt;4.0 mg·L-1)的6-BA抑制芽的生長,形成的芽矮小且顏色暗綠發(fā)黃；低濃度(lt;1.0 mg·L-1)的6-BA盡管在NAA、KT不同濃度的配合下也能使愈傷組織分化，但誘導低；適宜濃度(3.0 mg·L-1)的6-BA既可以保持較高的多芽數(shù)，又使芽健壯，葉片平展，葉色濃綠。

從因素NAA來看，濃度在0.1～1.0 mg·L-1的范圍內，其誘導率變化不明顯，但由于考慮到生長素對芽的生長有一定的抑制作用，故建議采用低濃度為宜。蔗糖濃度的大小對芽的分化也有較大的影響，太高或太低都不利于芽的分化，原因可能是由于滲透壓的改變而造成的。在16組試驗數(shù)據(jù)中，9號配方改良MS + 6-BA 3.0 mg·L-1+ NAA 0.1mg·L-1+蔗糖3.0%，誘導率和增殖系數(shù)都是最高的，且植株生長旺盛，很少出現(xiàn)褐化現(xiàn)象(圖1-2)，與正交實驗結果的最佳分化組合基本吻合，因此，9號培養(yǎng)基可以視為富貴菜誘導分化、增殖最適培養(yǎng)基。

2.3 不同激素濃度對富貴菜生根的影響

不同培養(yǎng)基對富貴菜試管苗生根的影響試驗結果見表5。由表5可見，激素IAA與NAA都能使富貴菜的試管苗生根。在只含有IAA的培養(yǎng)基中，隨著IAA濃度的增大，生根率升高，生根條數(shù)增多，根相對較細，容易生成氣生根。而在只含有NAA的培養(yǎng)基中，濃度為0.1～0.3 mg·L-1時，生根率均可以達到100%，植株長勢旺盛；NAA濃度較高時，生根率降低，根系生長慢，且易對植物造成毒害。本試驗中還發(fā)現(xiàn)，IAA、NAA配合使用，其生根率并不高，多氣生根，植株矮小。因此最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.3 mg·L-1+蔗糖3%(圖1-3、圖1-4)。

表5 不定根誘導試驗結果Table 5 The experiment result of root induction

2.4 富貴菜的煉苗與移栽

當試管苗根長到3～5 cm時，煉苗2～3 d，將根系上的培養(yǎng)基洗凈，植入腐殖土∶細沙=3∶1中，栽后用微噴法澆透水，使用塑料薄膜蓋好，相對濕度保持在75%以上，開始時每天噴水1～2次，7 d后逐漸轉入正常管理，成活率≥93%(圖1-5、圖1-6)。

3 小結與討論

通過對富貴菜離體培養(yǎng)再生體系的建立，得到了最佳培養(yǎng)條件及最佳植物生長調節(jié)劑的配比，解決了該種種質資源的保存與繁殖問題，為富貴菜試管苗工廠化生產奠定了堅實可靠的基礎。

本試驗發(fā)現(xiàn)，在完全黑暗的條件下，愈傷組織很難分化成不定芽，而是直接生根。說明光對愈傷組織誘導起著直接的作用，影響器官的形成。光照越強，愈傷褐化程度越高，這可能與組培初代培養(yǎng)過程中植物內源激素水平、培養(yǎng)物多酚氧化酶(PPO)活性及總酚含量有著密切的關系[5]。

愈傷誘導試驗中發(fā)現(xiàn)：(1)以葉片為外植體，添加6-BA有利于形成致密的愈傷組織，且在一定范圍內隨濃度的加大而誘導率升高(因為6-BA解除了腋芽由生長素所引起的頂端優(yōu)勢，促進其產生新的芽點或愈傷組織)；而添加2,4-D雖能誘導疏松愈傷組織，卻對致密愈傷組織的形成有較強的抑制作用。(2)6-BA與較低濃度的KT、NAA配合使用，可得到質量好、誘導率高、適宜分化的致密愈傷組織。

不定芽誘導試驗中發(fā)現(xiàn)：(1)6-BA的濃度變化對富貴菜致密愈傷組織誘導分化形成不定芽的影響最為顯著。一定范圍內，濃度越高，誘導率越大，但高濃度的6-BA則明顯抑制芽的分化；比較而言，分化培養(yǎng)基中細胞分裂素的濃度高于誘導培養(yǎng)基的，有利于芽的產生。(2)3%蔗糖濃度有利于富貴菜誘導、分化；濃度過低，愈傷組織相對疏松，不易形成芽點；濃度過高，易使愈傷組織褐化，出現(xiàn)衰老。

生根試驗中發(fā)現(xiàn)，將無菌苗插入土壤基質比無激素的培養(yǎng)基中高，這可能與栽培物質的透氣性有關，并且說明該植株體內，內源激素特別是生長素水平較高。因此在離體培養(yǎng)生根中，需借助于一些外源激素生長素類物質如NAA、IAA等。其中NAA更利于富貴菜無菌苗菜的生根。適宜濃度NAA誘導，根粗而長，植株生長旺盛；雖然IAA同樣能誘導生根，但根細而短，多氣生根；同時使用兩種激素誘導生根效果不佳，原因還需進一步探討。

[1]陳德春，劉紅昌，楊文鈺.四川地區(qū)富貴菜栽培技術[J].長江蔬菜，2005，(1)：19～20.

[2]鄭 華，葉定池，許方程.富貴菜人工栽培技術[J].中國蔬菜，2004，(4)：54～55.

[3]賀東方.富貴菜高產優(yōu)質栽培技術[J].長江蔬菜，2003，(11)：29～33.

[4]趙世樂，童小榮.富貴菜及其栽培[J].特種經(jīng)濟動植物，2002，(6)：36～39.

[5]楊 博，韓振海,張 永，等.不同光照強度對玫瑰組織培養(yǎng)中初代培養(yǎng)物褐化的影響[J].中國農學通報,2003,19(6):194～196.

Q813.1

A

1673-1409(2009)02-S056-05

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.016

2009-06-08

李 孌 (1981-)，女(苗族)， 湖南沅陵人，理學碩士，助教， 研究方向為細胞工程與資源植物學.

蔣道松，E-mail：roadpine@163.com.