蘇應兵，楊代勤 (長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

斑點叉尾鮰暴發(fā)性敗血癥的免疫預防研究

蘇應兵，楊代勤 (長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

通過試驗確定了嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)全菌苗的福爾馬林安全滅活濃度、最佳滅活溫度及時間，并選取最佳滅活方式，制備了全菌苗F-1、F-2和F-3。采用所得全菌苗免疫斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)，測定了其對斑點叉尾鮰的免疫原性。經(jīng)注射接種28 d后，受免斑點叉尾鮰血清中凝集抗體效價都有顯著增加。受免斑點叉尾鮰血液白細胞吞噬活性的測定結(jié)果表明，3個免疫組的吞噬百分比和吞噬指數(shù)都顯著地高于對照組。這表明，采用福爾馬林滅活的全菌苗F-1、F-2和F-3，均能在28 d內(nèi)刺激斑點叉尾鮰產(chǎn)生較強的免疫應答。

斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)；白細胞吞噬活性；免疫預防

隨著斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)養(yǎng)殖在全國各地的推廣，養(yǎng)殖產(chǎn)量大幅度提高，集約化生產(chǎn)能力加大。但其病害發(fā)生也日趨嚴重，尤其是苗種培育階段和成魚的后期養(yǎng)殖，各種病原體侵襲引發(fā)斑點叉尾鮰暴發(fā)性死亡時有發(fā)生，極大地影響了斑點叉尾鮰的產(chǎn)量、效益，病害已成為影響斑點叉尾鮰規(guī)?；a(chǎn)的“瓶頸”因素之一。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖者普遍使用抗生素等化學藥物來控制，一方面使致病病原體的抗藥性不斷增加，使機體的細胞免疫、體液免疫功能下降[1]；另一方面，對環(huán)境會造成嚴重的污染和破壞，同時，藥物殘留還會對食用者構(gòu)成潛在的威脅[2]。隨著對綠色環(huán)保食品和環(huán)境保護的要求及免疫學技術的發(fā)展，國內(nèi)外已有通過接種疫苗進行水生生物疾病控制的報道[3]。在我國，對疫苗免疫機理的研究多集中于血清抗體濃度和效價的提高等特異性體液免疫方面[4]。本研究通過確定嗜水氣單胞菌全菌苗的福爾馬林安全滅活濃度和最佳滅活溫度及時間，選取最佳滅活方式，制備嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌滅活全菌苗；同時，用全菌苗免疫斑點叉尾鮰后，分析其免疫指標和疫苗對斑點叉尾鮰的保護率，即凝集抗體效價、白細胞吞噬活性和免疫保護率，旨在探討采用滅活疫苗預防斑點叉尾鮰暴發(fā)性敗血癥的可能性，為斑點叉尾鮰的健康養(yǎng)殖提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

用于制備免疫原的菌株是從3種表現(xiàn)出血癥狀的患病斑點叉尾鮰中分離得到的3株致病病原菌，分別記為Jh-1、Jh-2和 Yh-3。經(jīng)分離、純化和鑒定，確定菌株Jh-1屬嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，菌株Jh-2和 Yh-3均屬溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)(另文發(fā)表)。

吞噬實驗所用金黃色葡萄球菌(staphylococcusaurreus)由長江水產(chǎn)研究所魚病室提供。試驗用健康斑點叉尾鮰取自長江水產(chǎn)研究所良種繁育基地，體長(16.5±1.0) cm，體重(39.0±0.5) g，暫養(yǎng)1周后備用。

1.2 免疫原的制備

將菌株Jh-1接種于普通蛋白胨牛肉膏液體培養(yǎng)基(pH7.2)，28 ℃恒溫搖床(150 r/min )培養(yǎng)18 h后，平板法測定細菌濃度，用無菌生理鹽水(0.5%,W/V)稀釋至5.0 × 109cfu/mL后，分組分別加入終濃度為0%、0.1%、0.2%、0.4%的福爾馬林，置4、28、60 ℃分別滅活，按設定時間取出滅活的菌液在無菌條件下3 000 r/min，30 min離心，去上清，再加入等量0.5%(W/V)魚用生理鹽水，然后劃線接種于FWA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察菌落生長情況，從而檢測滅活效果，確定福爾馬林安全滅活濃度和最佳滅活溫度。選取最佳滅活方式分別滅活Jh-1、Jh-2、Yh-3 3株菌株，滅活完成后，即分別得到對應的福爾馬林滅活的嗜水氣單胞菌(formalin killedA.hydrophila，F(xiàn)-1)和溫和氣單胞菌全菌苗(formalin killedA.sobria，F(xiàn)-2和F-3),置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌苗的安全性試驗

選取健康斑點叉尾鮰，胸鰭基部注射按前面所制得的滅活全菌苗F-1、F-2和F-3，每種菌苗各注射10尾，注射劑量為0.2 mL/尾，對照組10尾，注射等量無菌生理鹽水(0.5%，W/V) ，飼養(yǎng)15 d，觀察并記錄斑點叉尾鮰的活動情況。

1.4 金黃色葡萄球菌懸液的制備

將金黃葡萄球菌接種在液體肉湯培養(yǎng)基(上海生物制品廠出品)中，37 ℃下培養(yǎng)48 h，離心集菌，在菌液中加入濃度為0.5%的福爾馬林，37 ℃條件下滅活24 h，用滅菌生理鹽水清洗3次，并將其濃度稀釋至1.0×108cfu/mL，即為福爾馬林滅活的Staphylococussaurreus菌體(formalin killedS.aurreus，F(xiàn)-SA)，用作檢測白細胞吞噬活性。

1.5 免疫與采血

將健康斑點叉尾鮰分為3個免疫組和1個對照組，每組30尾，其中免疫組每尾從胸鰭基部注射0.2 mL菌濃度為1.0×108cfu/mL的滅活全菌苗；對照組每尾從胸鰭基部注射0.2 mL無菌生理鹽水(0.5%，W/V)。免疫后第28 d從各組中隨機取6尾魚，斷尾采血。將每尾魚的血液均分為2份，1份置常溫下凝血后分離血清，供檢測凝集抗體效價用；另1份以肝素(1%肝素鈉)抗凝，供分離白細胞測定其吞噬活性之用。

1.6 凝集抗體效價的測定

采用96孔血凝記數(shù)板進行。反應抗原為F-1、F-2和F-3菌苗。加樣后的血凝板首先在30 ℃條件下孵育1 h，然后置于4 ℃冰箱中，翌晨判定其結(jié)果。

1.7 白細胞吞噬活性的測定

在0.2 mL抗凝血中加入0.1 mLF-SA，搖勻，在28 ℃的恒溫水浴鍋中孵育45 min，每隔10 min搖動1次。用吸管吸取血細胞涂片，每個樣品涂5張，用甲醇固定10 min，Giemsa染色1 h，水洗風干后，鏡檢，并依下式計算白細胞吞噬百分比(phagocytic percentage,PP)和吞噬指數(shù)(phagocytic index,PI)。

1.8 免疫保護率的測定

免疫后第28 d，每組各取斑點叉尾鮰20尾，用分離到的病原菌攻毒，病原菌濃度為1.0×108cfu/mL，每尾用量0.2 mL，飼養(yǎng)觀察14 d，統(tǒng)計各組的死亡率，采用下式計算免疫保護率(relative percent survival,RPS)[5]。

免疫保護率(%)=(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌福爾馬林滅活濃度和溫度

在嗜水氣單胞菌菌懸液中加入不同濃度的福爾馬林，并置于不同溫度條件下進行滅活，不同濃度和溫度的滅活情況見表1。由表1可見，在60 ℃條件下，采用0.4%、0.2%、0.1%濃度的福爾馬林分別只需2 h及4 h即可使菌體細胞完全失活；而在28 ℃時，用此3種濃度的福爾馬林完全滅活菌體細胞的時間就延長至24 h、48 h和72 h，4 ℃時則分別達到4 d、8 d和8 d以上。從抗原性的保護和滅活效果綜合考慮，后續(xù)試驗中全菌苗的滅活選擇了0.2%福爾馬林，28 ℃滅活2 d。

表1 不同溫度和不同福爾馬林濃度對菌細胞的滅活效果Table 1 The detoxication effects of different formalin concentrations and temperatures on bacterial cell

注：+表示菌苗尚具活力，-表示菌苗完全失活。

表2 受免和對照斑點叉尾鮰血清中凝集抗體效價Table 2 Agglutinating antibody titre in the serum of immunized and control Ictalurus punctatus

注：括號中數(shù)字為幾何平均數(shù)。

表3 受免和對照斑點叉尾鮰血液白細胞對F-SA的吞噬活性Table 3 Phagocytic activity of blood leucocytes to formlin killed Staphylococcus aurreus of immunized and control Ictalurus punctatus

注：**表示與對照組差異極顯著， *表示與對照組差異顯著。

表4 活菌攻毒后斑點叉尾鮰的死亡率和免疫保護率Table 4 Mortality and relative percent survival of the experiment and control Ictalurus punctatus after challenged with live A.hydrophila and A. sobria

2.2 安全性試驗結(jié)果

注射了滅活全菌苗的30尾斑點叉尾鮰經(jīng)過15 d飼養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)有死亡現(xiàn)象或染病癥狀，說明所用疫苗的注射劑量對斑點叉尾鮰是安全的。

2.3 凝集抗體效價

用F-1、F-2和F-3分別接種斑點叉尾鮰后28 d后，血清中凝集抗體效價的測定結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，3株菌苗注射接種斑點叉尾鮰28 d后，受免斑點叉尾鮰血清中凝集抗體效價均不同程度地上升，其中以F-1免疫組最高，平均為1∶60.8；F-2免疫組其次，平均為1∶48.0；凝集抗體效價最低的為F-3免疫組，平均僅為1∶30.4。而對照組血清的凝集抗體效價都很低，平均為1∶6.4。

2.4 血液中白細胞的吞噬活性

由表3可以看出，3株菌苗注射接種斑點叉尾鮰28 d后，受免斑點叉尾鮰血液中白細胞的PP，均極顯著地高于對照組(Plt;0.01)，PI也均顯著地高于對照組(Plt;0.05)； 其中F-1和F-2免疫組的白細胞的PP和PI極顯著地高于對照組(Plt;0.01)。

2.5 免疫保護率

由表4可以看出，斑點叉尾鮰對全菌苗F-1、F-2和F-3分別產(chǎn)生了相應的免疫保護，其免疫保護率分別為52.9%、47.1%和35.3%。

3 討論

滅活疫苗的制備，關鍵是確定適宜的滅活劑濃度，滅活溫度及滅活時間，這其中使病原菌完全滅活是第一重要的。陳月英等[6]在研究養(yǎng)殖魚類敗血癥的嗜水氣單胞菌苗時，認為用0.15%～0.2%福爾馬林，4 ℃時只需1 d就可使菌細胞滅活。而本研究結(jié)果中，菌株Jh-1 4 ℃ 0.2%的福爾馬林至少需要8 d才能使其失活。形成以上差異的原因可能是由于菌株之間的個體差異或菌液濃度不同，但本研究結(jié)論與楊先樂等[5]認為鱉嗜水氣單胞菌4 ℃ 0.2%的福爾馬林至少需要12 d才能使鱉嗜水氣單胞菌失活的結(jié)果較接近。

一般認為，在使致病菌體足以滅活的各種方法中，較溫和的滅活條件，即較低的溫度與較低的福爾馬林濃度(或較短的福爾馬林作用時間)，能有效地保護滅活疫苗的免疫性抗原[6]，本試驗結(jié)果也證實了這一點。但是，楊先樂等[5]認為，并不是所有較低滅活的溫度與較低的福爾馬林濃度對抗原的損失均較小，這一現(xiàn)象在對草魚出血病的細胞培養(yǎng)滅活疫苗的研究中也曾出現(xiàn)。因此，在本試驗中全菌苗的滅活選擇了0.2%福爾馬林，28 ℃滅活2 d。但是，滅活條件對滅活疫苗免疫原性的影響是復雜的，只有找出它們之間的相互關系，才能制造出高效價的滅活疫苗，這需要今后進一步研究探索。

硬骨魚類的吞噬細胞及其構(gòu)成的單核巨噬系統(tǒng)是魚類捕捉抗原和清除病原微生物的重要防御系統(tǒng)[7]。一般認為，動物體內(nèi)的吞噬細胞可吞噬進入體內(nèi)的異物，在動物體的非特異性免疫中發(fā)揮重要作用。白細胞中的顆粒細胞和單核細胞等都與機體的抗感染免疫有密切聯(lián)系，其中的嗜中性顆粒白細胞和單核細胞等對入侵的病原微生物具有吞噬和殺滅作用，對保持機體生理狀態(tài)穩(wěn)定和免疫保護是非常重要的[8]。魚類的嗜中性白細胞和單核細胞已經(jīng)被證明具有較強的吞噬能力，這種能力對于特異性免疫機能相對于高等脊椎動物來說比較低下的魚類而言，具有更為重要的意義。因此，通過測定血液中白細胞的吞噬功能，可以反映機體的非特異性細胞免疫狀態(tài)[9]。免疫原性是抗原刺激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞的特性。Estevez等[10]報道了通過檢測血清凝集抗體效價來評價受免魚的體液免疫應答水平；陳昌福等[11]通過檢測受免魚的血液白細胞的吞噬活性來評價受免魚的細胞免疫應答水平。因此，通過檢測受免魚血清凝集抗體效價和血液中白細胞的吞噬活性來考察抗原的免疫原性是合理的。

從本研究結(jié)果可以看出，用福爾馬林滅活后得到的全菌苗F-1、F-2和F-3，經(jīng)注射接種斑點叉尾鮰28 d后，受免斑點叉尾鮰血清中凝集抗體效價都有顯著增加。對受免和對照斑點叉尾鮰血液白細胞吞噬活性的測定結(jié)果表明，3個免疫組的PP和PI都顯著地高于對照組。這表明，用福爾馬林滅活后得到的全菌苗F-1、F-2和F-3，均能在28 d內(nèi)刺激斑點叉尾鮰產(chǎn)生較強的體液及細胞免疫應答。

本研究結(jié)果顯示,對受免斑點叉尾鮰進行活菌攻毒后,斑點叉尾鮰對全菌苗F-1、F-2和F-3分別產(chǎn)生了相應的免疫保護，但免疫保護率均偏低，分別為52.9%、47.1%和35.3%，這可能因為只進行了1 次免疫，如再次免疫，很可能會提高免疫力，這有待于進一步探討。另外，由于氣單胞菌抗原結(jié)構(gòu)比較復雜，全菌苗免疫效果可能會受到限制，而其致病因子的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，因此，可考慮從氣單胞菌的致病因子著手，尋找共同的保護性抗原，以研制更有效的疫苗。

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S942.5

A

1673-1409(2009)02-S032-04

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.011

2009-06-05

蘇應兵(1978-)，男，湖北天門人，農(nóng)學碩士，助教，主要從事水生動物疾病學研究.